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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea,PED）的病原体,PEDV的感染会导致严重的腹泻、呕吐和脱水,造成极高的死亡率,给养猪行业带来巨大经济损失和危害。为了更好地预防和控制PEDV的流行,最有效的方式就是在易感物种中接种疫苗,开发有效疫苗的关键是对病毒入侵、病毒在细胞中复制等病毒感染过程的研究。病毒感染宿主细胞的过程包括病毒吸附并与宿主细胞表面受体结合、病毒脱壳和病毒基因组复制、核衣壳与病毒基因组的组装、宿主细胞溶解并释放出病毒等。由于PEDV还存在许多变种以及地方性流行毒株,为控制和预防PEDV的流行增加许多困难,因此开发出高效的疫苗和抗病毒药物对养猪行业意义重大。CD26/DPP4是一种丝氨酸蛋白酶,广泛分布于各种组织和细胞中,具有多种生物学功能。CD26/DPP4不仅与糖尿病和心血管疾病相关,还被发现作为中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）的细胞表面受体。MERS-CoV与PEDV同属冠状病毒属,并且有研究表明丝氨酸蛋白酶家族中的跨膜丝氨酸蛋白酶2（Transmembrane protease serine 2,TMPRSS2）和跨膜丝氨酸蛋白酶13（Mosaic serine protease large-form,TMPRSS13/MSPL）可以促进PEDV在Vero细胞中的复制,并促进病毒-细胞融合、细胞-细胞融合,这在病毒的感染中发挥了重要作用[1]。CD26/DPP4在Vero细胞中表达,并且Vero细胞是培养PEDV的常用细胞系。因此本实验通过使用CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR-Cas9）技术在CD26/DPP4第2外显子设计sgRNA,将单链sgRNA退火聚合成双链的g DNA,再将gDNA连接到pX330载体上,连接gDNA前还需用限制性内切酶BbSⅠ将pX330载体线性化,以此构建CD26/DPP4 sgRNA表达载体。通过电击转染的方法将CD26/DPP4 sgRNA表达载体转染到Vero细胞,经过筛选获得单克隆细胞。通过PCR鉴定,本实验共获得26个阳性克隆细胞,选择Vero-KO-DPP4-1、Vero-KO-DPP4-12、Vero-KO-DPP4-34、Vero-KO-DPP4-58四种阳性克隆以及Vero-KO-DPP4-24/25两种杂合克隆细胞,以Vero细胞为对照通过Western Blot检测CD26/DPP4蛋白质的表达情况,发现阳性克隆细胞的CD26/DPP4蛋白质表达水平低于Vero细胞,其中Vero-KO-DPP4-34号阳性克隆明显低于Vero细胞。PEDV感染克隆细胞后,通过检测病毒拷贝数、病毒滴度和间接免疫荧光（indirect immunofluorescence,IFA）检测PEDV复制水平发现,Vero-KO-DPP4-34克隆细胞中的PEDV复制水平低于Vero细胞中的病毒复制水平,但病毒仍然可以感染克隆细胞,推测可能是由于CD26/DPP4并非是PEDV入侵Vero细胞唯一受体。通过检测克隆细胞的细胞增殖能力和细胞凋亡发现,4株阳性克隆细胞的增殖能力明显低于Vero细胞,但在细胞凋亡检测中只有Vero-KO-DPP4-34细胞的凋亡情况与Vero细胞有差异。因此本实验旨在通过CRISPR/Cas9技术对Vero细胞的CD26/DPP4基因进行敲除,在获得CD26/DPP4基因敲除型Vero细胞后,检测PEDV在克隆细胞中的复制水平。研究CD26/DPP4对PEDV复制的影响,为进一步探讨PEDV入侵Vero细胞的过程提供理论基础,同时,为研究PEDV潜在的治疗靶点,或为疫苗生产工艺中提高病毒滴度和扩大病毒产量提供新的思路。