马凡氏综合征（MFS）是由于编码原纤维蛋白-1的基因突变而导致的一种常染色体显性遗传结缔组织病,由此引发的主动脉瘤破裂是患者死亡的主要原因。现有的手术治疗及药物治疗效果不甚理想,亟需在MFS发病机理的研究上产生突破,以期找到更为精准有效的治疗方法。主动脉中层的平滑肌细胞以及弹力纤维层是主动脉壁维持正常生理功能的基本单位,中层的平滑肌细胞的凋亡、功能失常以及弹力纤维的降解是MFS主动脉瘤发生发展的主要原因。因此,研究导致平滑肌细胞行为异常以及弹力纤维层断裂崩解的原因成为MFS升主动脉瘤发病机理的主要研究方向。长链非编码RNA （lncRNA）是一类长度超过200nt的非蛋白编码RNA,近年来的研究表明,lncRNA广泛参与基因的表观遗传调控、基因转录和转录后调节以及miRNA的调控等生物学过程,且已有研究证实某些lncRNA在平滑肌行为的调控方面展现着重要的作用。而lncRNA在MFS血管病变中的研究尚未见相关报道,鉴于其在心血管发育以及平滑肌行为调控方面所展现出的多样化的调控机制,我们认为在MFS血管病变的发生发展过程中,某些lncRNA起着至关重要的调控作用。本课题利用人的组织样本,通过芯片高通量筛选差异表达的mRNA和lncRNA,进一步运用生物信息学分析的方法找到与MFS升主动脉瘤发生发展密切相关的lncRNA,重点研究其在调控主动脉平滑肌行为和重构血管平滑肌细胞外基质中的作用,找到一个导致MFS发生血管病变的关键信号通路,从而确定新的、特异、敏感的治疗靶点,为实现MFS的精准治疗,改善MFS临床治疗现状提供坚实的理论基础。研究内容主要包含以下三个部分第一部分：MFS升主动脉组织mRNA及lncRNA表达谱检测及相关的生物信息学分析实验组选取10例MFS患者,在外科手术时获取升主动脉组织。对照组组织来源于冠状动脉硬化患者,在接受搭桥手术主动脉壁打孔时获取升主动脉组织。所有样本均在离体后直接放入液氮中冻存。使用TRIZOL法提取总RNA,使用NanoDrop检测总RNA的纯度；利用变性琼脂糖胶,检测总RNA的完整性,综合运用上述方法挑选出总RNA质量最优的5组样本,进行后续的高通量分析。使用Affymetrix最新高通量芯片HTA2.0 （GeneChip Human Transcriptome Array2.0）,检测两组升主动脉组织中mRNA以及lncRNA的表达情况,对所有芯片数据进行三维模型的主成分分析（3D-PCA）,判断样本间的离散水平,删除离散度高的样本,对剩余数据做更进一步的生物信息学分析。用Limma算法筛选两组之间的差异mRNA及lncRNA,对差异表达的mRNA进行功能显著性分析（GO-Analysis）,得到差异mRNA所显著影响的功能；对差异mRNA进行信号通路的显著性分析（Pathway-Analysis）,得到差异基因所参与的显著性信号转导通路；以显著性GO为研究对象,基于GO的层次结构,通过构建功能关系网络（GO-Trees）,总结实验影响的功能群体,以及显著性功能间的内在从属关系；以显著性Pathway中包含的差异基因为研究对象,构建基因间相互作用关系网络（Gene-Act-Net）,从而得到差异基因构成的信号转导关系网络以及差异基因中位于中枢位置的核心调控基因；对显著性Pathway中包含的差异基因和显著性GO中包含的差异基因取交集,命名为交集mRNA;以交集mRNA和差异lncRNA为研究对象,通过基因自身的实测表达值构建基因间的共表达网络（Co-expression-Network）,从网络中确认处于疾病关键调控环节的lncRNA。运用荧光定量PCR （qRT-PCR）验证相关的lncRNA以及mRNA的表达。在MFS升主动脉组织中,研究共筛选到显著差异表达的602个mRNA以及376个lncRNA （Fold change>1.5, P<0.05）,功能显著性分析（GO-Analysis）结果显示,差异表达的mRNA主要参与炎症反应、细胞外基质重构等相关的生物学进程；差异基因的信号通路生物信息学分析结果显示,PPAR以及一些代谢相关的信号通路发生了显著下调的改变,而ECM-receptor interaction、protein digestion and absorption、PI3K-AKT以及TGF-β等信号转导通路则出现了显著上调的改变。通过构建相应的mRNA-lncRNA共表达网络及计算差异K-core值,我们发现lncRNA NR₀24430极有可能在MFS血管病变的发生发展中起关键性的调控作用,且进一步的qRT-PCR验证了lncRNA₀24430在MFS升主动脉组织中的显著下调。第二部分：lncRNA NR₀24430在MFS血管病变发生发展中的作用和具体机制该部分利用人主动脉原代平滑肌细胞（sciencell6110）对lncRNA NR₀24430的功能及起作用的具体机制进行深入探讨。利用RNA原位杂交技术（RNA-FASH）研究了lncRNANR₀24430在原代平滑肌细胞中的定位；运用反义核苷酸技术（antisense oligonucleotides, ASOs）,敲低原代平滑肌细胞中的lncRNANR 024430,研究其在原代平滑肌中的功能；利用RNA测序技术（RNA-Seq）,结合相关的生物信息分析方法,深入探讨研究lncRNA NR₀24430所影响的下游分子及生物学功能,并使用qRT-PCR技术验证NR 024430所影响的下游的信号分子。利用体外转录技术结合高通量蛋白组学技术（HuProt2.0）,需找NR 024430所能调节的具体蛋白调节因子,深入探讨其起作用的具体分子机制。研究进一步使用重组人TGF-β1刺激人主动脉原代平滑肌细胞,探讨NR 024430所参与的信号转导通路与非经典TGF-β信号通路之间的关系。研究结果显示,lncRNANR₀24430表达定位于原代主动脉平滑肌的细胞核内,RNA-Seq的结果显示,敲低原代主动脉平滑肌细胞中的NR 024430,显著增加到了平滑肌细胞的凋亡率（P<0.05）,且可以促进平滑肌细胞分泌相关的炎症细胞因子,促进平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶-1、9（MMP-1、9）,而这些改变均为MFS血管病变发生发展中的关键生物学事件。进一步的研究发现,NR 024430所参与的调节过程,独立于非经典的TGF-β信号转导通路,且两条通路互为补充,均在MFS主动脉瘤的进展中起重要的作用。蛋白组学的结果显示与NR 024430相互结合蛋白大部分为转录因子,我们推测NR 024430的分子生物学功能很有可能与这些转录因子的调控息息相关。第三部分：MFS中平滑肌状态行为的改变该部分使用MFS小鼠模型FBN1 C1039G/+,结合HE染色及免疫荧光染色技术,观察MFS小鼠升主动脉平滑肌细胞的形态改变;运用TUNEL技术,检测MFS小鼠升主动脉平滑肌细胞凋亡情况；使用qRT-PCR技术,检测人升主动脉组钙相关蛋白mRNA表达的变化；利用Fluo-4标记细胞胞浆钙,结合激光共聚焦显微镜,检测MFS小鼠升主动脉平滑肌细胞钙库钙含量的变化。研究结果显示,MFS小鼠升主动脉平滑肌排列明显异常,出现簇状聚集现象,平滑肌细胞凋亡显著,且人MFS组织中ryr2的表达显著下调,钙库检测结果显示MFS平滑肌细胞内钙库钙含量明显多于正常对照。结论1.lncRNANR₀24430在MFS升主动脉组织中显著下调。2.NR₀24430主要表达于原代主动脉平滑肌细胞的细胞核。3.NR₀24430参与了MFS主动脉瘤的发生发展。4.敲低NR₀24430可以诱导原代主动脉平滑肌细胞发生凋亡。5.敲低NR₀24430可以促进原代主动脉平滑肌细胞分泌相关的炎性细胞因子。6.敲低NR₀24430可以促进原代主动脉平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶-1、9（MMP-1、9）,这些酶与主动脉中层弹力纤维的降解息息相关。7.TGF-β1可以促进原代主动脉平滑肌细胞分泌MMP-2。8.NR₀24430所参与的调节过程,独立于非经典的TGF-β信号转导通路,且两条通路互为补充,均在MFS主动脉瘤的进展中起重要的作用。9.MFS平滑肌细胞行为状态异常（凋亡增加、排列异常、钙库钙含量上调）。