论文部分内容阅读
背景内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指由于某些原因导致细胞内质网生理功能发生紊乱,钙稳态失衡,错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理状态,它是使错误折叠的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工所必需的步骤,是一种细胞自我保护的机制。通过ERS可使细胞恢复稳态,但是过强或长时间的ERS则可导致细胞凋亡。ERS反应性凋亡途径是近年来发现的有别于死亡受体途径及线粒体凋亡途径的细胞凋亡途径。但有文献报道,肿瘤细胞对ERS介导的凋亡有明显的抵抗作用,通过特异性干预手段来提高其对凋亡的敏感性是一种新的治疗策略。凋亡抵抗是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的特征之一,在HCC发生发展中占有重要地位。凋亡抵抗产生的原因非常复杂,研究发现环氧化酶-2(cycloxygenase-2, COX-2)有明显的抑制凋亡作用,已引起人们的广泛关注。大量的研究表明COX-2在肝癌组织中高表达,COX-2的表达可以促进肿瘤细胞的增殖、抵抗细胞凋亡、参与血管形成、促进肿瘤转移,COX-2抑制凋亡作用被认为是HCC化疗抵抗的重要原因。本研究利用ERS诱导剂衣霉素(Tunicamycin, TM)诱导人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞株HL-7702发生ERS,通过观察其增殖情况及细胞凋亡的变化及检测COX-2表达的变化,并观察选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用于ERS下肝癌细胞后,其增殖情况及细胞凋亡的变化及COX-2的表达变化,来探讨肝癌细胞抵制ERS反应性凋亡的可能机制。目的了解肝癌细胞ERS后COX-2的表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法MTT法检测人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞株HL-7702的增殖情况；流式细胞仪PI单染法检测细胞周期DNA含量分析凋亡率,TUNEL法观察药物作用细胞后凋亡细胞形态变化；Western blot法检测糖调节蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)及COX-2蛋白表达的变化。结果1.肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后细胞增殖情况的变化采用MTT法,观察人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株HL-7702发生ERS后增殖情况的变化。结果显示系列浓度的ERS诱导剂TM(1.5,3,6,9,12umol/L)作用HepG2和HL-7702细胞48h后,二者的增殖抑制率分别为14.21士6.11%,20.83±3.16%,18.16±4.21%,24.23±6.32%,24.6±6.13%和54.22±1.32%,64.75±3.43%,64.18±1.56%,60.37±2.47%,64±1.35%。具有显著差异(P<0.01)。2.肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后细胞凋亡的变化2.1肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后细胞凋亡变化的TUNEL分析采用末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)观察HepG2和HL-7702细胞发生ERS后细胞凋亡的形态学改变。典型的凋亡细胞形态特征包括核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中等。结果显示,HL-7702及HepG2细胞正常对照组细胞呈上皮型贴壁生长,细胞呈延展、扁平,核膜、核仁轮廓明显。细胞间结构紧密,细胞生长旺盛。HL-7702细胞发生ERS后细胞密度明显减少,凋亡细胞明显增加。而HepG2细胞发生ERS后仅见少许凋亡细胞。2.2肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后细胞凋亡变化的FCM检测应用流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测细胞凋亡率。在DNA图谱Go/G1期前出现了一个代表细胞凋亡的亚G1峰即凋亡峰。FCM结果显示,HL-7702及HepG2细胞正常对照组可见低矮的凋亡峰；当HL-7702细胞产生ERS后,其凋亡峰升高,细胞凋亡率为21.43±1.44%；但HepG2细胞发生ERS后,细胞凋亡率仅为3.92±0.51%。二者具有显著差异(P<0.01)。3.肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后COX-2的变化采用Wertern Blot检测肝癌细胞及正常肝细胞发生ERS后COX-2的变化。结果表明,3umol/L TM可诱导GRP78的表达增多,提示ERS的产生。HepG2细胞发生ERS后,COX-2的表达随TM作用时间的延长表达逐渐增多。HL-7702细胞发生ERS后基本检测不到COX-2的表达。4.塞来昔布对ERS下的肝癌细胞增殖情况的影响将系列浓度塞来昔布(5umol/L, lOumol/L,20umol/L,40umol/L)作用于应激后的HepG2细胞。MTT结果显示,其增殖抑制率分别为33.58±2.91%、44.72±2.84%、68.92±2.23%和84.83±0.17%,当塞来昔布的浓度为10umol/L时,增殖抑制率即非常显著。5.塞来昔布对ERS下的肝癌细胞凋亡的影响选取10umol/L塞来昔布和3umol/LTM作为实验浓度。TUNEL染色结果显示,加入塞来昔布后,HepG2细胞的凋亡细胞比例明显增加。同时FCM结果显示,加入塞来昔布后,HepG2细胞的凋亡峰明显增高,细胞凋亡率为30.57±3.56%。而塞来昔布对HL-7702细胞的凋亡无明显影响。FCM结果及TUNEL结果进一步说明了塞来昔布可以增强肿瘤细胞对ERS性凋亡途径的敏感性。6.塞来昔布对ERS下肝癌细胞COX-2表达的影响选取10umol/L塞来昔布及3umol/L TM共同作用于HepG2细胞24h,Western Blot法检测细胞中COX-2的变化。结果显示,塞来昔布抑制了COX-2表达,提示COX-2可能是肝癌细胞抵制ERS性凋亡的重要原因。结论肝癌细胞ERS后可上调COX-2的表达,抑制COX-2的表达可以显著提高ERS下肝癌细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率。COX-2可能在肝癌细胞抵制ERS反应性凋亡中起重要作用。