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胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase;COD)在医疗检测和食品开发等方面的有很好的应用前景,本研究以提高酶稳定性为目标,借助生物信息学方法对酶分子的三维结构进行定点诱变预测,并采用原位理性取代的手段对酶序列进行改造,以期达到提高热稳定性能的目的。主要结果如下:(1)将Rhodococcus sp.源(CODr)与Streptomyces SA-COO源(CODs)胆固醇氧化酶的lid区序列与结构进行同源比对,针对lid区设计删除突变和插入突变,结果发现CODrM1(删除4个氨基酸)及CODr-M2(插入Ala)的热稳定性都有所降低,其中CODr-M1的底物特异性有所改变,对孕烯酮醇的催化活性显著提高,验证了lid区域与酶的底物特异性有关联。(2)应用生物信息学软件Rosetta,对CODr的506个氨基酸位点分别进行模拟突变并计算解折叠自由能的变化以及总能量,输出可能引起正向突变的计算结果,进行酶分子突变实证操作,得到了六株热稳定性正向提高突变株(D71G,N86H,P149D,P354D,N459G和P464E),这些点都位于结构的表面,其中N86H获得较理想的正突变效应,热稳定性提高2.6倍。(3)以定点突变和组合突变技术相结合,筛选热稳定性提高的正突变株。观察酶的模拟结构,N86位于酶表面的lid上,对N86位点进行定点突变,发现His是最佳的替代氨基酸,在N86H的基础上,结合D71G,N86H,P149D,P354D及Q108E进行组合突变,组合突变酶的热稳定都进一步提高,其中N86H/D71G的热稳定性最佳,t1/2为26.6min,是原酶的3.9倍。酶学性质研究发现,组合突变酶对胆固醇的催化活性都有所降低。(4)从结构角度诠释热稳定性提高的分子机理。突变酶CD谱研究认为增加α螺旋或β折叠含量使酶热稳定性增强。对突变酶结构进行同源模拟,发现上述的点突变并未改变蛋白质的主体骨架结构,只是影响局部的氨基酸残基之间的相互作用,酶分子内部氢键力增强以及酶表面的疏水键力减弱,可能是促进酶热稳定性有所提高的原因。