论文部分内容阅读
流感病毒（Influenza Virus）能够引起人和动物呼吸道传染病。世界卫生组织首先以病毒蛋白为依据，将其分为甲、乙、丙三种类型，再根据病毒表面结构蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的不同分为种类繁多的血清亚型。迄今已经发现17种HA亚型，NA亚型有10种。H1，H3亚型主要引起人、猪、禽的流行性感冒，并且每年因疾病流行给人类带来巨大的经济损失。流感病毒抗原表位变异快，血清亚型众多，新型疫苗制备困难加大。将流感病毒表面的亚型优势表位被筛选组合，构建可预防多种亚型流感的多表位核酸疫苗。目的在于抵御传播快、变异快，血清型多的流感流行。将已构建的多表位核酸疫苗质粒（pVAX1-H3-EHA-H1HA1new，pVAX1-H3-H1HAnew，pVAX1-EHA），进行了发酵条件摸索及工艺建立。结果表明，两种多表位核酸疫苗质粒最佳发酵条件为：培养体系20L，接种子液2L，37℃培养9h，最佳溶氧量是30%，最佳PH值为7.25。培养过程中流速补加葡萄糖可显著延长大肠杆菌生长的对数生长期，获得较高菌量，增加量为0.3Kg。将菌体应用碱裂解法进行质粒的大量提取后，应用阴离子交换层析方法（QSepharose XL）对所得质粒进行纯化。结果表明，自建的两步过滤法可有效除去细胞碎片和其他杂质，色谱柱纯化方法可有效除去RNA、蛋白质和宿主基因组DNA，获得纯度较高的质粒DNA。本实验证明了所建立的制备工艺的可行性，为DNA疫苗的大规模生产提供了可借鉴的技术数据。最后，将多表位核酸疫苗进行了免疫实验研究。实验结果表明，多表位疫苗免疫组可刺激小鼠机体产生与共表达H1、H3亚型流感HA蛋白免疫组相当的H1亚型特异性IgG抗体水平。与共表达亚型流感HA蛋白的免疫组相比，多表位疫苗免疫组小鼠T淋巴细胞转化效果最好，说明多表位盒设计的添加，可提高机体免疫应答水平，促进了小鼠的细胞免疫反应。此外，多表位疫苗组产生的IL-4细胞因子水平表明，多表位盒中含有的B细胞表位可刺激小鼠产生较多的Th2类细胞因子，诱导体液免疫显著，与IgG抗体检测结果相符，证明了免疫组多表位核酸疫苗可诱导特异性细胞免疫和体液免疫。