转基因克隆兔相关影响因素的研究

来源 :广西大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lzg31142003
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一、对兔卵母细胞的孤雌激活方法进行探讨,为兔体细胞核移植的研究奠定良好基础。将体外成熟培养20~22h的兔卵母细胞随机分组,分别进行以下试验:采用不同脉冲电压、脉冲次数和脉冲时间,电激活兔卵母细胞,摸索最佳电激活参数;比较不同激活方法处理兔卵母细胞的激活效果,I:Ion5min+6-DMAP3h,Ⅱ:Ion5min+CHX3h,Ⅲ:Ion5min+6-DMAP联合CHX3h,Ⅳ:电激1次联合6-DMAP+CHX3h;优化6-DMAP与CHX作用时间。结果显示:当电激参数为:电压40V/mm,脉冲时间20μs和脉冲次数3次时,兔孤雌胚的分裂率和囊胚率最高,可达80.64%和14.51%;采用第Ⅳ种方法激活兔的卵母细胞,胚胎的分裂率和囊胚率(80.64%,13.71%)均显著高于Ⅰ组(66.67%,8.6%)和Ⅱ组(43.21%,1.24%,p<0.05),略高于第III组(77.59%,12.07%);当兔孤雌胚分别在含6-DMAP和CHX的CM中培养lh和3h时,lh组在分裂率(80.68% Vs77.59%)和囊胚率(15.91%Vs12.07%)上都略高于3h处理组,但差异不显著(p>0.05)。   二、对兔孤雌激活胚胎培养的条件进行优化,旨在建立一个完善的兔胚胎体外培养体系,为兔体细胞核移植的研究奠定基础。试验一:探讨三种不同的培养基(CM、M-199、G1/G2)对兔孤雌胚胎体外发育效果的影响;试验二:比较分别采用不更换培养液、每天更换培养液、隔天更换培养液方法培养兔孤雌胚胎的体外发育效果;试验三:在M-199+10%FBS的培养液中添加一定量的氨基酸,探讨氨基酸对兔孤雌胚发育的影响。结果显示:兔孤雌胚胎在M-199+10%FBS组培养其分裂率和囊胚率(79.59%,14.28%)均显著高于CM组(47.48%,5.75%)和G1/G2组(21.00%,0.00%)(P<0.05)。采用每天更换或隔天更换培养液的方法培养兔孤雌激活的胚胎,这两组胚胎的卵裂率(76.39%和79.59%)与不更换培养液的对照组(73.68%)相比,三组之间差异不显著(P>0.05),但这两组的囊胚发育率(9.72%和14.28%)显著的高于对照组(1.75%)(P<0.05),而这两组之间差异不显著(P>0.05)。在M-199培养液中添加氨基酸后,囊胚发育能力显著高于对照组(29.88% VS13.92%,P0.05),但囊胚发育率差异显著(20.59% VS33.33%,P<0.05);(3)比较3种不同方法(脂质体法、磷酸钙法和电穿孔法)转染的兔胎儿成纤维细胞核移植后重构胚的发育情况,发现用电穿孔法转染的兔胎儿成纤维细胞其重构胚的囊胚发育率显著高于脂质体法和磷酸钙法(44.44% VS20.59%和20.00%,P
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