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1.1研究背景及目的无菌动物(Germfree animals,GF)指无可检出一切生命体的动物,进一步说,是指用现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。无菌动物具备以下几大特点:首先无菌动物可彻底排除背景微生物的干扰,无菌动物背景清晰,不携带任何活的微生物及寄生虫,用于构建菌群、菌株移植模型,可以彻底排除背景微生物的干扰;其次人体是由自身细胞和微生物细胞共同构成的“超级生物体”,无菌动物对于解析菌群宏基因组功能不可或缺。利用无菌动物技术“转入”(菌群移植)或“敲除”(无菌化)菌群,对于解析特定菌群宏基因组对疾病的影响尤为重要,犹如利用基因工程动物技术转入或敲除某一基因,对于解析该基因对疾病的贡献一样重要。随着高通量测序技术的发展,越来越多的科学家发现肠道菌群与诸多疾病发生存在必要关联,利用无菌小鼠制备菌群移植模型、悉生动物模型等能够更好地解析菌与人的关系,所以各研究单位对无菌小鼠的需求量出现逐年上升趋势,但国内现有的商品化无菌小鼠远远满足不了市场的需求。目前影响无菌小鼠培育进度的技术难点在于获得原代小鼠难、繁殖率低、无菌小鼠营养需求不详等因素。无菌小鼠的培育主要采用生物净化法,即剖腹产手术全子宫摘除,将仔鼠通过人工喂养的方式获得。能否成功喂养出无菌小鼠的关键在于有无适合无菌小鼠生长发育的营养配方饲料,包括哺乳期生长发育所需的奶制品以及生长繁殖期所需的饲料。而目前关于无菌小鼠营养需求相关研究相对较少,国际上针对无菌小鼠哺乳期及离乳后生长繁殖阶段均没有标准饲料,这极大地影响了大规模发展无菌小鼠培育工作进度。同时无菌小鼠为适应无菌环境,其生物学特性发生了巨大变化。因不能发酵食物中的多糖,盲肠变得膨大;为摄取更多的营养物资,其肠壁更薄、绒毛更长;无菌小鼠的免疫系统因缺乏微生物抗原刺激处于低发育水平;同时无菌动物基础代谢率更高、不易积累脂肪;其应激反应、行为学特征等均有异于常规动物。正常小鼠肠道菌群能够合成身体新陈代谢所需的B族维生素和维生素K,一般不会缺乏,而无菌小鼠肠道没有细菌,普通小鼠饲料里B族维生素和维生素K的含量满足不了无菌小鼠正常的生长繁殖需要,加之无菌小鼠饲料经高剂量辐照灭菌之后,部分营养成分损失严重。所以依据其生物学特征及生活环境提示无菌小鼠的营养需求异于普通小鼠,普通小鼠的饲料不适用于无菌小鼠的喂养。为了解决上述问题,本课题结合正常仔鼠哺乳期及生长繁殖阶段的生理生化指标及营养需求,最终配制出适合无菌小鼠哺乳期生长的人工配方奶和适合繁殖阶段生长的强化饲料,同时接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型,通过16s r DNA高通量测序分析,进一步验证了强化饲料与菌群移植模型的关系。1.2方法(1)依据小鼠鼠奶营养成分,对比婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组哺乳期KM小鼠张耳、睁眼、长毛等生长特性,统计离乳率,同时持续采集哺乳期乳鼠体重、尾长生长情况,对比小肠组织切片,运用统计学分析软件Graph Pad Prism6.0分析小鼠血常规结果及血气理化指标,从而评价婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组组间差异。(2)依据实验动物小鼠纯化饲料标准AIN-93G,参照对比辐照消毒前后饲料中营养成分的损失程度,结合无菌小鼠体内不能合成维生素B族及维生素K的特点,配制成强化饲料。运用统计学分析软件SPSS19.0分析普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组生长阶段体重变化情况,性成熟后连续交配3次,统计分析小鼠受孕率、产仔及离乳数,随机抽取各组5只小鼠,对比其凝血四项指标及心脏组织切片,从而评价普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组的组间差异。(3)接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型小鼠,分别饲喂与宿主相同的婴儿奶粉和强化饲料,对菌群定植14天及28天的小鼠粪便进行16s r DNA高通量测序分析菌群相似度。1.3结果(1)婴儿奶粉组人工喂养137只乳鼠,离乳0只,人工配方奶组人工喂养124只乳鼠,成功离乳72只,离乳率58%。婴儿奶粉组与正常对照组体重尾长差异明显(P﹤0.01),人工配方奶饲喂无菌KM仔鼠其体重、尾长增长与正常对照组基本一致(P﹥0.05),红细胞计数、白细胞计数、血小板计数均无显著性差异(P﹥0.05),血液酸碱度无显著性差异(P﹥0.05),氧分压有显著性差异(P﹤0.05)。由此可见,人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期的生长需求。(2)普通饲料组(实验1组)与正常对照组比较其3-6周龄体重增长存在显著性差异(P﹤0.05),而强化饲料组(实验2组)与正常对照组无明显差异(P﹥0.05)。到达性成熟后,普通饲料组(实验1组)受孕率、产仔离乳数存在显著性差异(P﹤0.05),强化饲料组(实验2组)与正常对照比其受孕率、产仔离乳数无统计学意义(P﹥0.05),强化饲料组(实验2组)凝血四项值无明显差异(P﹥0.05),普通饲料组(实验1组)小鼠心脏组织切片有少量出血点,提示该组小鼠出现病理性出血,普通饲料不能用于无菌KM小鼠喂养,而通过营养改良后的强化饲料能基本满足无菌KM小鼠生长繁殖需求。(3)菌群定植14天时,奶粉组婴儿肠道菌群模型小鼠在“目”水平,肠道菌梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)与婴儿粪便的梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)丰度相似。菌群定植28天时,婴儿肠道菌群模型小鼠饲料组与奶粉组肠道微生物菌落差异不明显,强化饲料适用于模型动物。1.4结论(1)人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期生长的营养需求(3)强化饲料的营养成分能基本满足无菌小鼠生长繁殖的营养需求(3)强化饲料能够维持菌群移植模型小鼠的菌群多样性结构,适用于菌群移植模型