目的：建立GFP标记的同胎、同种异系及异种成骨细胞腹直肌袋异位移植模型，检测其诱导的体液免疫及细胞免疫反应，预计组织工程骨移植及骨细胞移植的宿主免疫反应情况，观察移植物在体内的转归过程，进而从移植生理学及种系的角度研究工程骨及细胞移植种子细胞的可靠来源，展望工程骨及骨细胞移植的临床应用前景及适用范围。 方法：(1)成骨细胞原代培养及GFP标记：成骨细胞培养取材于5周龄大耳白兔胫骨骨膜，用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化后接种培养。SD大鼠成骨细胞取材于生后3天SD大鼠颅骨，方法同上。取生长良好细胞，用脂质体包裹质粒pIRES2-EGFP进行转染，培养后更换筛选培养基扩增，并经电镜及荧光显微镜鉴定。 (2)动物分组与细胞移植：同种异系移植组A，同胎移植组B，异种移植组C，自体移植组D各12只。细胞注入腹直肌袋内。A、B组注入兔成骨细胞，C组注入SD大鼠成骨细胞，D组注入自体耳廓软骨悬液。 (3)检测指标：包括用ELISA法进行血清内抗体的检测，用3H-TDR掺入法淋巴细胞转化试验检测细胞免疫情况，用MTT法进行淋巴细胞细胞毒试验检测是否有CMC的参与。注射部位肌肉组块经固定包埋，在不同断面连续3张切片， 第四军医大学硕士学位论文 一 经荧光显微镜观察后，行HE染色观察。 结果：山血清抗体检测：阳性抗体组的吸光度A值与自体移植组差异显著。 析因分析表明：同组不同抗原稀释度的A值随稀释度的减小而升高：不同组抗 体出现时间不同，A组于术后2周出现，4周消退：B组于术后4周出现，8周 消退：C组于术后2周出现，4周达峰值，8周消退，存在时间最长。不同组不同 时间点间行配对t检验表明：异种移植组相对吸光度最高，与其它组差异显著。 （2）淋巴细胞刺激试验：PHA对自体移植组淋巴细胞增值影响不大，同胎移 植组刺激指数在各时间点与自体移植组无显著性差异，而与另两组差异显著； 同种异系组刺激指数于术后2周开始升高，至第4周达峰值，8周缓慢消退，与 自体移植组差异显著；异种组刺激指数的变化趋势于同种异系组相似，但自第2 周起刺激指数己显著高于同种异系组。 （3）Mrt淋巴细胞毒试验：自体移植组与同胎移植组的杀伤活性无显著性差 异；同种异系组及异种组的杀伤活性与术后两周开始与对照组产生显著差异，至 术后4周达峰值，术后8周时开始缓慢消退；异种组淋巴细胞杀伤活性于术后2 周起显著高于同种异系组，至术后8周不变。 （4）形态学检查：术后1周，各组均可见少量淋巳细胞及多核巨噬细胞浸润： 术后2周，同种异系组炎性细胞浸润较前明显，异种移植组组织切片内可见大 片炎性浸润灶：术后4周，异种组炎性细胞浸润较前减退且无成骨细胞存活； 术后8周，A、B组仍可检测到成骨细胞，A组观察到异位成骨现象。 讨论：改良的成骨细胞体外培养方法将酶消化法和组织块法结合，在短时 间内获得大量较高纯度的成骨细胞，简便实用，适用于当前组织工程组织体外 培养的需要l‘－3］。荧光标记细胞己广泛应用于多学科的研究，但 GFP的应用却始 于 1996年［‘］，国内未见有 GFP转染成骨细胞的报道，本研究首次成功建立了经 4 第四军医大学硕士学位论文 一 脂质体包裹GFP标记的成骨细胞系，进而改良了PetCr等l’1在1998年建立的成 骨细胞异位移植模型，从而为移植物转归的研究提供了更有效的手段。利用该 模型，我们对各种来源的成骨细胞移植后的免疫倩况及转归进行了检测，实验 发现自体及同胎成骨细胞移植后不会引起明显的兔疫排斥反应，这在其它的研 究中己得到相似的结果，同胎动物的基因重和率与同基因动物十分接近，因此 同胎个体间的细胞移植的免疫反应弱。同种异系成骨细胞移植以其广阔的应用 前景成为本研究的重点，研究发现同种异系成骨细胞移植后可引起受体体液免 疫及细胞免疫指标的升高，移植后4－8周最明显，但移植后8周仍可检测到其 在异体内存活，说明同种异系成骨细胞异位移植后不会被受体排斥，仍具有一 定的生物活性，说明同种异体组织工程骨及细胞移植是可行的，虽未观察到异位 成骨，但增加移植浓度或进行转基因处理后，其仍具有可观的应用价值。异种 器官移植的研究表明【‘－＼基因型相合的异种移植物似乎受细胞介导的免疫机制 排斥，类似于同种异体排斥。实验表明，单纯成骨细胞异种移植可引起明显的 体液及细胞免疫指标的升高，且明显高于同种异系移植的情况，但并没有出现 如异种骨移植的强烈反应。这主要是因为骨组?