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基因工程技术,尤其是以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)克隆表达系统为基础的原核基因工程技术,使得人们可以在E.coli中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白,用于蛋白质结构和功能的解析以及临床医疗。然而,通常用基因工程技术从Ecoli中获得一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品,仍然面临着严峻的技术挑战。其中,作为生物工程“下游技术”的重要部分的重组蛋白复性和纯化,往往是在E.coli中生产特定真核蛋白的技术“瓶颈”,要占生产总成本的70-90%。因此,本论文将通过基因工程手段分别构建的重组干扰素-γ(recombinant human interferon-γ,rhIFN-γ)和重组人干细胞因子(recombinant human stem cell factor,rhSCF)的原核表达载体,并实现在E.coli中高效表达。用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)对不含有二硫键rhIFN-γ进行复性并同时纯化;主要用LC法完成rhSCF的复性并同时纯化工艺研究,获得了可供临床使用的rhIFN-γ和rhSCF,并为基因工程产品的不断完善提供实验依据。 论文包括以下九个部分: 1.文献综述 目前,在基因工程药物生产中由于E.coli具有遗传背景清楚、操作简单、生长周期短、产量高、成本低等显著优点,在重组蛋白生产的过程中E.coli仍占着主导地位。hSCF是一类作用于多系的造血细胞生长因子,与其它的生长因子有较好的协同作用,具有恢复造血的功能。虽然在E.coli中表达的重组蛋白和天然蛋白具有相同的生物活性,但迄今为止,在原核细胞中表达重组蛋白都存在表达量较低、表达产物存在于包含体组分以及包含体复性效率较低等问题。其中重组蛋白的复性一直是大量获得有功能的基因工程产品的技术“瓶颈”。因此,通过基因工程手段获得多种可供临床使用的造血细胞因子,一方面具有重大的临床、经济和社会效益,另一方面也可为基因工程下游技术的不断完善提供实验依据。整个文献综述共引用了135篇文献和四个图。 2.重组人干扰素-γ在大肠杆菌中高效表达和色谱复性 从健康人外周血分离单核细胞,经LPS刺激后提取总RNA。用反转录-聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增hlFN-γ的互补DNA(Complementary deoxynucleic acid,cDNA)。将扩增的产物克隆后进行序列分析证