背景及意义：由创伤、肿瘤或代谢疾病等各种原因造成的骨缺损发生率很高,骨缺损的重建一直都是骨科医生面临的一个极具挑战的临床难题。目前应用于临床的骨移植修复材料主要包括自体骨、同种异体骨、异种骨、人工骨等。自体骨作为植骨的“金标准”无可否认,但往往取骨量有限,因此很难对大范围骨缺损进行修复。同种异体骨是目前常用的骨移植材料,主要用于修复、填充骨缺损,具有固定和支撑作用,但其来源有限,不能完全满足临床植骨需求。异种骨材料不受来源限制,经适当处理即可作为骨移植替代材料修复骨缺损,其移植可很好地解决临床上自体骨与同种异体骨来源不足的问题,但异种骨面临的主要问题是如何降低其免疫原性及植骨排斥反应,以达到良好的植骨融合效果。我国是一个拥有众多人口、幅员辽阔的发展中国家,地质灾害、生产事故、交通意外等时有发生,由此造成人员伤亡导致的骨缺损病例大量存在,因此国内市场对骨缺损材料需求量较大。异种骨来源丰富,可以满足这一需求,但其移植后会发生免疫排斥反应,为解决其免疫排斥,相继有许多不同方法处理的异种骨出现,目前市场上已出现多种能应用于临床的异种骨,如Kiel骨、Bio-OSS、RBX重组合异种骨,其治疗效果显著,安全性也得到认可。目的：本实验分体内实验及体外实验两部分,体外实验采用材料浸提液在体外与细胞共培养的方法检测超临界C02、环氧固定等技术制备并复合骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein BMP-2)的生物型异种猪松质骨对成骨细胞增殖活性、迁移能力及细胞周期的影响,评价与成骨细胞的体外生物相容性。体内实验评价生物型异种骨应用于山羊颈椎的椎间融合效果,进一步为生物型异种骨移植材料应用于临床提供安全性和有效性的依据。材料：生物型异种松质骨：由广东冠昊生物科技股份有限公司采用已获得美国专利授权(US6106555A,US6231614B1)的技术制备；SD大鼠成骨细胞株由广州军区总医院骨科实验室液氮冻存；成年本地山羊18只,体重25-30kg,由广东冠昊生物科技有限公司动物实验中心提供。第一章异种骨与成骨细胞体外生物相容性研究方法：将SD大鼠来源的成骨细胞分别在普通培养基和含异种骨浸提液的培养基中培养,于1、3、5、7天用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium, MTT)法测定吸光度值,以评价细胞的增殖情况。采用Transwell试验,在倒置相差显微镜下观察细胞的迁移情况,计算穿膜成骨细胞数量,检测成骨细胞的迁移能力。应用流式细胞仪检测细胞周期变,以评价异种骨浸提液对成骨细胞细胞周期的影响。实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析,以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验,P<0.05为有统计学意义。结果：1成骨细胞增殖活性培养1、3、5、7d后在显微镜下观察可见实验组与对照组成骨细胞形态均良好。MTT法测定OD值可间接反应细胞增殖数量,实验组与对照组相比,随着培养时间延长,OD值均升高,在1、3、5、7d时间点,数据统计学分析显示两组间吸光度值差别均无统计学意义(P>0.05),表明异种骨浸提液对成骨细胞增殖活性无不良影响,与成骨细胞相容性良好,无明显细胞毒性。2成骨细胞的迁移能力Transwell试验中通过在高倍镜下(×200)随机取5个视野计数,计数每个视野的平均细胞数量评价成骨细胞在普通培养基与含异种骨浸提液培养基的迁移能力。本实验中实验组迁移的细胞数目为：13.40±2.51个／视野,对照组迁移的细胞数目为：8.00±1.87个／视野,数据统计学分析显示两组差别有统计学意义(P<0.05),实验组细胞迁移数量多于对照组,表明异种骨复合BMP-2后可促进成骨细胞迁移。3流式细胞术检测成骨细胞周期实验组与对照组成骨细胞培养24小时后流式细胞术检测,Millipore软件分析实验结果示：实验组G0/G1、S、G2/M分别所占细胞周期百分比为：69.92±1.31%、3.83±0.31%、16.56±1.20%；对照组G0/G1、S、G2/M分别所占细胞周期百分比为：71.61±1.69%、4.06±0.28%、17.24±0.94%,数据统计学分析显示两组间差别均无统计学意义(P>0.05)可见两组细胞各期分布相似。表明异种骨浸提液对成骨细胞细胞周期无不良影响。结论：采用超临界CO2、环氧固定等技术制备并复合骨形态发生蛋白-2的生物型异种猪松质骨对成骨细胞增殖能力及细胞周期无不良影响,能促进成骨细胞迁移,具有良好的生物相容性。第二章生物型异种骨应用于山羊颈椎融合的实验研究方法：18只成年本地山羊,体重25-30kg,随机分成A组：自体髂骨组,B组：PEEK融合器加自体骨组,C组：PEEK融合器加生物型异种骨组,每组6只。三组均行C3-C4椎间盘切除术并植入以上内植物。于术前、术后即刻及术后4、8、12、24周时分别拍摄颈椎正、侧位X光线片,并在侧位X线片上测量C3-C4的平均椎间高度(discspace height, DSH),术后12、24周行CT检查,并每组处死3只山羊,取C3-C4节段标本通过大体观察及组织学方法评价脊柱愈合情况。实验所得数据采用SPSS20.0统计软件进行分析,以均数±标准差(x±s)表示,椎间高度及CT影像学评分整体采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用Bonferroni检验,P<0.05为有统计学意义。结果：1一般情况1只山羊术后当天因麻醉相关并发症死亡,随后补上1只替代。术后山羊正常进食及放养,术后切口轻度肿胀,于第5天肿胀基本消失。术口愈合良好,无感染、渗液及排斥反应等。2标本大体观察术后12周时A组上下椎体间大部分融合,融合节段可见大量纤维性骨痂；B组及C组融合器与上下椎体融合较为紧密,结合处也可见大量纤维性骨痂。术后24周时A组两椎体完全融合,B组及C组融合器与上下椎体结合紧密,未见明显间隙。3影像学分析3.1X线检查融合情况术后即刻X线片显示3组山羊融合节段区可见较明显间隙,无骨小梁通过。术后4周时,A组可见融合节段区密度有所增高,B、C组融合节段区略模糊,密度较A组稍低,周围可见软组织影。术后12周时,A组融合节段区密度较前增高,与椎体骨界面模糊,可见骨小梁通过,B组融合节段区密度较A组低,骨小梁较少,C组融合节段密度与A组相比无明显差别,也可见较多骨小梁通过。术后24周时,A组融合节段区密度较前明显增高,与正常骨分界消失,B组融合节段密度较A组稍低,也可见大量骨小梁通过,与正常骨分界基本消失,C组融合节段与正常骨分界消失,密度与A组相比无明显差别。术前及术后即刻三组动物所测量DSH无组间差异。术后4、8、12及24周B组及C组平均DSH值均大于A组(P<0.05),差异有显著性意义,而B组、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.2CT扫描及评分结果术后12周时A组部分CT层面可见融合器与椎体界面间隙稍模糊,部分新生骨形成,少见骨性连接；B、C组部分CT层面可见新生骨形成,融合器与椎体界面间隙模糊程度较A组轻。术后24周时,A组绝大部分CT层面均可见新生骨形成,融合器与椎体之间已形成骨性连接；B、C组同样可观察到大部分CT层面新生骨形成,融合器与椎体之间有大量骨小梁,形成骨性连接。术后12周时,A组融合度评分较B、C组高(P<0.05),B组与C组间数据统计差异无显著性意义(P>0.05)；术后24周时,三组间数据统计差异无显著性意义(P>0.05)。4组织学检查术后12周时,A组可见自体髂骨块被纤维骨痂包裹,大量新骨形成骨小梁结构,并可见毛细血管形成；B组PEEK融合器周围可见纤维骨痂包裹,融合器界面可见大量新骨生长入,较多毛细血管形成；C组PEEK融合器周围也可以大量纤维骨痂包裹,大量新骨长入,异种松质骨部分降解,较多毛细血管形成。术后24周时,A组的自体髂骨块与椎体间的新生骨小梁已改建为成熟的骨小梁,纤维骨痂被成熟骨性骨痂代替,植骨块与椎体间已完全骨性融合；B组PEEK融合器周围纤维骨痂被骨性骨痂代替,可见成熟骨小梁,融合器与椎体形成骨性融合；C组在PEEK融合器边缘可见大量成熟的骨小梁组织,异种松质骨已完全降解被正常骨替代,大量骨性骨痂,融合器已椎体已完全形成骨性融合。结论：在颈椎椎间融合中,椎间融合器加生物型异种骨植骨融合比自体三面皮质髂骨植骨融合可更好地维持颈椎生理曲度,降低椎间隙塌陷发生率,可获得与自体三面皮质髂骨植骨融合及椎间融合器加自体骨植骨融合同样的融合效果,是一种理想的椎间融合材料,在临床上有广阔的应用前景。