肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,S.Enteritidis)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Pullorum,S.Pullorum)和鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Gallinarum,S.Gallinarum)是兽医临床常见的沙门氏菌血清型。三者在进化关系上非常相近,具有类似的基因组结构,但在宿主范围、宿主年龄和致病特点上却存在很大差异。肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原体,通常引起食物中毒和肠胃炎。而鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌则主要对幼龄禽类致病,引起急性、全身性和败血性疾病。此外,值得注意的是,包括肠炎沙门氏菌在内的多数沙门氏菌,均具有鞭毛,能运动,而鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌却是两个例外,它们的菌体表面没有鞭毛表达且不具备运动性,但对于它们无鞭毛且缺乏运动性的原因,长期以来并没有被明确阐释。鞭毛是细菌表面长丝状的附属物,是细菌的运动器官,此外,作为一种重要的毒力因子,鞭毛在细菌对宿主细胞的粘附、侵袭以及生物被膜形成等致病过程中发挥重要作用。细菌鞭毛的合成和组装过程非常复杂,有一系列基因(不少于60个)参与到这个过程中。本课题组在对鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌鞭毛相关基因进行检索时发现,虽然鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌不具备鞭毛结构,但它们的基因组内包含全系列的鞭毛相关基因。有趣的是,在它们的鞭毛相关基因中,存在一定数量的假基因。而在鞭毛功能完整的肠炎沙门氏菌的鞭毛相关基因中,则不存在假基因。假基因(Pseudogene)是基因组中与功能基因非常相似的DNA序列,但因存在点突变、缺失和插入等缺陷而丧失正常编码功能,常用“Ψ”表示。那么,是否所有的鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌都具有鞭毛相关假基因?假基因的分布和突变具有何种特点?鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的无鞭毛表型是否是由某些功能基因突变为假基因导致?此外,有研究表明,病原微生物某些毒力相关基因的假基因化,可能会影响其致病性。那么,鞭毛相关基因的假基因化,是否会影响菌株的致病力?基于上述科学问题,展开以下研究:1.鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌鞭毛相关假基因的测序和生物信息学分析为了探析鞭毛相关假基因在鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌中的数量、分布和突变形式等规律,本研究首先从NCBI基因组数据库中获取目前已公布的鸡白痢沙门氏菌(共5株)和鸡伤寒沙门氏菌(共3株)全基因组序列。其次,以肠炎沙门氏菌P125109(已知鞭毛阳性)的全基因组序列(AM933172.1)为参考序列,设计特异性引物,用PCR方法分别扩增本实验室保存的鸡白痢沙门氏菌国内标准株(4株,包括CVCC523、CVCC526、CVCC535 和 CVCC540)的flgK、flhB、flhA、flgI、cheM、fliN、fliL、motB、ycgR基因并测序。将测序获得的序列以及从NCBI获取的序列分别与参考序列进行比较和分析。结果表明,与参考序列相比,在分析的12株鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌菌株中,均含有2～6个数量不等的鞭毛相关假基因。各个假基因的分布情况不同,其中flgK、flhB在所有被分析的鸡白痢和鸡伤寒菌株中均是假基因。假基因的突变形式具有多样性。总体来讲,分为两种情况:(1)单个碱基突变导致序列中提早产生终止密码子。(2)非三的整数倍碱基插入或缺失,导致下游产生移码突变。本研究对鞭毛相关假基因分布规律和突变特点的掌握,为进一步对鞭毛相关假基因的研究打下基础。2.肠炎沙门氏菌鞭毛相关假基因的缺失及其对鞭毛形成和运动性的影响为了进一步探究各鞭毛相关假基因对鞭毛形成和菌株的运动性的影响,本研究以已知鞭毛和运动阳性的肠炎沙门氏菌国内标准株CMCC(B)50336为研究模型,利用λ-Red同源重组系统,构建flgK、flhB、flhA、flgI、cheM、fliL、fliN、motB和ycgR基因的缺失株。通过半固体运动试验、玻板凝集试验和电子透射显微镜观察的方法,检测各基因缺失株的鞭毛形成能力和运动性,从而分析各基因与鞭毛形成和运动性相关性。本研究证明:基因flgK、flhB、flhA、fgI、fliL和fliN同时影响鞭毛形成和运动性;基因motB影响运动性,但不影响鞭毛形成;基因cheeM和ycgR则既不影响鞭毛形成,也不影响运动性。3.flgK和flhB基因缺失对肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336致病力的影响前期研究表明,包括flgK、flhB、flhA、flgI、fliL和fliN在内的6个基因的缺失可以导致菌株产生无鞭毛表型,本研究进一步探讨无鞭毛表型是否影响菌株的致病性。我们以突变频率最高(100%)的两个基因(flgK和flhB)为切入点,通过考察flgK和flh和B基因缺失株的生物学功能变化,分析无鞭毛表型与肠炎沙门氏菌50336致病力之间的关系。结果显示,与野生株相比,缺失株50336△flgK和50336△flhB对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2、人结肠癌Caco-2的粘附能力均显著降低(p<0.05)。对IPEC-J2细胞、Caco-2细胞、鸡巨噬细胞HD-11和小鼠巨噬细胞RAW264.7的侵袭能力均显著降低(p<0.05)。然而,缺失株 50336△flgK和 50336△flhB 在 HD-11 细胞和 RAW264.7 细胞内的生存能力显著提高(p<0.05)。以上结果表明,鞭毛相关基因flgK和flhB缺失导致的无鞭毛表型,可以促进肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336在巨噬细胞内的生存能力。4.基因flgK和fhB的假基因化对肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336鞭毛形成和运动性的影响前期研究表明,鞭毛相关基因flgK和flhB的缺失直接影响肠炎沙门氏菌鞭毛的形成,但flgK和flhB基因的假基因化对其鞭毛和运动的影响并不知晓。本研究利用温敏质粒pHSG415介导的基因同源重组,将肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)国内标准株CMCC(B)50336基因组中功能基因flgK和flhB,替换为源自鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorum)的假基因ΨflhBsP和ΨflgKSP,分别构建了flgK和flhB假基因化的菌株50336ΨflhBSP和50336ΨflgKSP。通过半固体运动试验、玻板凝集试验和电子透射显微镜观察,结果显示,肠炎沙门氏菌基因flgK和flhB的假基因化,导致菌株不能形成鞭毛且运动性丧失。上述结果说明,flgK和.flhB基因的假基因化能够影响鞭毛形成和运动性。5.基因flgK和flhB假基因化对肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336致病力的影响本研究对上一章研究中基于肠炎沙门氏菌50336构建的flgK和flhB假基因化菌株进行生物学功能分析。结果显示,与野生株相比,置换株50336ΨflhBsp和50336ΨfgKSP对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞、人结肠癌Caco-2细胞的粘附能力均显著降低(p<0.05)。对IPEC-J2细胞、Caco-2细胞、鸡巨噬细胞HD-11和小鼠巨噬细胞RAW264.7的侵袭能力均显著降低(p<0.05)。但是,置换株50336ΨflhBSP和50336ΨflgKSP在HD-11细胞和RAW264.7细胞内的生存能力显著提高(p<0.05)。以上结果表明,肠炎沙门氏菌50336菌株flgK和flhB的假基因化致使其对宿主细胞的粘附和侵袭能力均降低。相反,flgK和flhB的假基因化使其在巨噬细胞内的生存能力增强。6.鸡白痢沙门氏菌假基因ΨflgK和ΨflhB的修复及其鞭毛相关功能分析本试验对CVCC535和CVCC540菌株中假基因ΨflhB和Ψflgk进行修复。首先,将源自S.Enteritidis的功能完整的.flhBSE基因无痕置换到S.Pullorum CVCC535和CVCC540基因组的相应假基因的位置,构建了基因flhB修复株CVCC535flhBSE和CVCC540flhBSE。继而将携带源自S.Enteritidis的功能完整的flgKSE基因的回补质粒转化入上述置换株中,构建了基因flgK和flhB双修复株CVCC535flhBSE/pBRflgKSE和CVCC540flhBsE/pBRflgKsE。通过半固体运动试验、玻板凝集试验和电子透射显微镜观察,结果表明,假基因flhB和flgK修复后的S.Pullorum菌株依旧不能形成鞭毛,不具备运动性。上述结果提示,在S.Pullorum的鞭毛编码系统中或许还存在其他假基因有待发现,因此揭示S.Pullorum无鞭毛表型的机制仍亟待更多的研究。本研究综合表明,flhB和flgK基因的缺失或假基因化,均会影响肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336的鞭毛形成和运动能力。flhB和flgK基因的假基因化影响了肠炎沙门氏菌CMCC(B)50336的致病性,即有助于其在巨噬细胞内的存活。