Ste20-like kinase(SLK)在小鼠卵母细胞中的定位与功能的初步研究

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减数分裂是遗传学的基础,它保证了有性生殖生物个体世代之间染色体数目的稳定性,为有性生殖过程中创造变异提供了遗传的物质基础。小鼠卵母细胞的减数分裂是极端的不对称分裂,分裂过程中排出非常小的不具有生物学功能的极体和含有大部分母源物质的卵细胞,为后期的受精和早期胚胎发育做准备。丝氨酸/苏氨酸相似激酶(ste-20like kinase)是在进化上是非常保守的微管相关蛋白,并且是Rho-GTPase Cdc42/Rac主要的下游靶蛋白,参与许多重要细胞活动,例如细胞迁移,细胞骨架重组以及诱导细胞凋亡和影响细胞周期进程等,是细胞有丝分裂所必需的。首先,本文针对SLK在小鼠卵母细胞减数分裂过程中四个典型时期GV期,GVBD期,MI期,MII期,即培养小鼠卵母细胞Oh,2h,8h和16h的RNA水平表达量进行研究,通过RT-PCR的方法检测。验证了SLK在各个时期的RNA水平表达量很高,并且随着减数分裂进程的推进,逐渐增加。其次,主要针对SLK在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的表达和定位进行了研究。检测了小鼠卵母细胞体外培养的Oh,2h,8h和16h,即相应的小鼠卵母细胞成熟的GV期,GVBD期,MI期,MII期SLK的表达和定位情况。证实了SLK在小鼠卵母细胞减数分裂过程中各时期表达均衡全过程。通过免疫荧光染色方法,发现SLK特异性地定位于减数分裂各期的染色体着丝粒上。同时,通过NOCO对卵母细胞进行处理后,利用染色体扩展方法对SLK在卵母细胞染色体上的定位与表达进行了研究。实验显示在小鼠卵母细胞减数分裂过程MI和MII时期,经过NOCO处理,SLK的定位和表达明显强于对照组,实验结果说明经过NOCO处理将微管蛋白和染体色着丝粒之间的连接破坏之后,SLK的表达明显增强。该结果显示SLK与微管相关。对于纺锤体与染色体连接是非常重要的。然后,主要针对SLK与Crest在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的定位关系进行了研究。本文中采用染色体扩展的试验方法对二者进行了研究。实验显示,SLK在小鼠卵母细胞减数分裂全程都有定位,在Pro-MI,MI和MII主要定位在染色体着丝粒上,并且SLK与Crest共染实验显示二者共定位于染色体着丝粒上。实验结果说明SLK与检验点蛋白相关,为了研究SLK与检验点蛋白有着怎样的关系,我们设计了下一个实验进行进一步研究。为了验证SLK与检验点蛋白的相互关系,本文对SLK与Mad1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的定位关关系进行了研究。使用染色体扩展的试验方法对二者的定位进行了研究,实验结果显示SLK和Mad1在小鼠卵母细胞Pro-MI期共定位于染色体的着丝粒上。但是,在卵母细胞分裂中期(MI),MAD1离开着丝粒,同时SLK依然存在于着丝粒上。当NOCO处理以后Mad1在分裂后期又回到着丝粒上与SLK相重合。实验结果说明SLK与检验点蛋白Mad1有着密切的关系。最后,为了研究SLK在小鼠卵母细胞中的功能,利用显微注射方法对小鼠卵母细胞注射Si-RNA和Morphlinor,对SLK进行敲降,来观察研究SLK对于减数分裂进程的影响,实验结果显示,SLK对小鼠卵母细胞减数分裂进程时间以及成熟率影响不显著。通过以上研究表明,SLK对于小鼠卵母细胞减数分裂过程是十分重要的。因此对于SLK的研究同时也是十分必要的。本文中就针对SLK小鼠卵母细胞减数分裂进程中进行了详细的研究。
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