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5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,ALA)是生物细胞内四氢吡咯和卟啉类化合物合成的重要前体,是包括叶绿素、亚铁血红素及维生素B12等化合物在内的共同底物,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。长期以来,关于ALA检测方法的研究主要集中在溶液中,包括水溶液、体液和发酵液。到目前为止,对于海洋微型生物细胞内ALA的研究尚未有报道。因此,本文重点研究了海洋微型生物细胞内ALA的测定,并初步研究了其主要代谢影响因素,以期更好地深入认识海洋微型生物的重要有机分子代谢过程。本论文主要包括了三个方面的工作:1)建立细胞内ALA检测方法,并首次将方法应用于野外自然水域,发现主要在生物密度和生物种类存在明显特殊性的区域(同安湾赤潮区与龟山岛浅海热液区)中水体生物颗粒物内存在较高的ALA含量,探讨了在这些自然水域环境中微型生物细胞内存在较高ALA浓度的可能原因。2)通过室内培养实验,对比研究海洋典型代表性微型生物(微绿球藻(Nannochloropsis oceanica)、聚球藻(Synechococcus sp.WH 7803))细胞内ALA含量随时间的动态变化,并进一步探究了真核生物与原核生物合成ALA的过程与差异;3)通过系列室内微绿球藻调控培养实验,发现培养基条件发生改变时,细胞内ALA及金属元素也发生动态变化,推测ALA的合成与其他合成前体及相应金属元素有关。具体研究成果如下:1)成功建立了测定海洋微型生物细胞内5-氨基乙酰丙酸(ALA)的柱前衍生高效液相色谱法。主要步骤如下:首先,通过甲醇酸细胞裂解液、涡旋混合及超声破碎等方法使细胞破裂,将细胞内的ALA充分暴露出来,使用氯仿提取疏水有机物,此时ALA溶解于水相中。然后,使用InertSustainC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),以甲醇-水-冰醋酸(500:500:10,V/V/V)为流动相进行洗脱。ALA水溶液标准曲线浓度0-20μg/L间与色谱峰面积值之间呈现良好的线性关系,回归系数均在0.999以上。室内培养实验样品的加标回收率在98.7%-100.3%。将细胞内ALA的测定方法应用于野外环境样品分析中,调查了九龙江河口区与流域、同安湾赤潮区、珠江口、闽江水口库区和龟山岛热液区等20余次航次的样品,结果显示,多数航次的样品ALA浓度均低于检出限(0.035μg/L),龟山岛热液区与同安湾赤潮区样品中ALA有检出,通过对比不同调查区域的特征发现,野外环境水体颗粒物内ALA的浓度可能与调查区域主要浮游生物种类及平均细胞丰度有关。龟山岛热液区白泉口与黄泉口主要浮游生物群落(Zhang et al.,2012)分别是硫还原菌(Nautilia、Thermococcus)、硫氧化菌(Thiomicrospira、Eurychaeota),平均细胞丰度为(18-71.9×108cells/L),远高于其他调查区域,水体颗粒物内含ALA浓度最高可达到0.35nmol/L;同安湾赤潮区赤潮生物为血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea),平均细胞丰度约69.1×104cells/L,赤潮区水体颗粒物内ALA浓度显著高于非赤潮区及其他调查区域,达到39.9nmol/L。2)在室内培养实验中,随着微藻的生长,细胞内ALA浓度也呈现出相应的动态变化。对于微绿球藻而言,在培养初期,细胞丰度为(0.6±0.1)×106cells/mL,此时ALA快速合成,在第2-3天时细胞内ALA浓度达到最大值约413±11μmol/L。随着微藻的生长,ALA浓度逐渐降低。当生长进入平台期(第9-10天)后,细胞内ALA浓度也趋于稳定,约3±0.5μmol/L,此时微绿球藻细胞丰度约为(2.8±0.2)×106cells/mL。在聚球藻培养过程中,培养初期细胞丰度为(0.7±0.1)×106 cells/mL,此时ALA浓度较低,低于检出限,当细胞进入指数生长后期约第9天(细胞丰度为(3.7±0.4)×106cells/mL)时有检出,并在平台期时浓度快速升高,最高值达到32.9±4.7mmol/L,其浓度增长滞后于细胞的指数生长,是微绿球藻细胞内ALA浓度最高值的100倍左右,且与微绿球藻细胞中ALA浓度的动态变化呈现相反的趋势。这可能与生物种类不同有关(Kipeeta1.,1980;Lineta1.,1989),微绿球藻属于真核藻类,体内主要的色素是叶绿素;聚球藻是光合细菌属于原核生物,其体内主要的色素是藻红素。Sasikala(1994)曾指出在自然界中可以合成ALA的生物有许多,但一般动物和植物自身合成量很低,而光合细菌等能够大量合成ALA(部分可分泌到细胞外),这可能是本论文发现在聚球藻培养中ALA浓度较高的原因。3)由于ALA合成过程中涉及到基本的有机小分子,因此在微绿球藻添加培养实验中,通过控制变量的方法改变培养基条件,将实验分为5组:f/2培养基对照组;葡萄糖添加组;甘氨酸添加组;谷氨酸添加组;ALA添加组。五组细胞内ALA随生长的动态变化趋势一致,在培养初期大量合成,指数期开始前达到最高值,然后逐渐下降,自指数中期趋于稳定,并维持在最低值。四个添加组与对照组相比,细胞丰度与细胞内ALA均有显著提高(p<0.05),谷氨酸添加组平台期时细胞丰度显著高于其他五组,达到20X106cells/mL;ALA添加组细胞内ALA浓度极显著高于其他五组,最高浓度达到84.8mmol/L。细胞态金属元素对培养基中的添加物同样也有不同程度的差异性反馈,可能与这些细胞对金属元素的需求有关。对照组各金属元素浓度最高,谷氨酸添加组浓度最低。在生长初期Fe、Co、V元素浓度较高,以刺激细胞的生长和满足物质、能量代谢的需求,动态变化与ALA趋势一致;Mg元素的动态变化与Fe、Co、V的趋势不同,生长周期中呈现基本平稳或略有升高的趋势。综上,本论文首次将海洋微型生物细胞内ALA的检测方法应用于野外水域中,发现了在不同水体环境颗粒物内ALA浓度存在差异;并通过实验室培养与调控实验,发现真核与原核生物细胞内ALA合成存在差异,微绿球藻细胞内ALA合成与培养基条件和细胞态金属元素水平相关。海洋微型生物细胞内ALA的测定与研究可能为进一步评估海洋初级生产力提供线索,有助于深入研究海洋生物泵、碳氮循环等。