研究目的动脉粥样硬化症是脂质代谢异常导致的动脉血管壁的慢性炎症性疾病,是心绞痛、急性心肌梗死或猝死等急性冠状动脉综合征的主要病理基础,已经成为严重影响我国中老年人健康的常见疾病,并有逐年递增的趋势。尽管动脉粥样硬化的发病机制尚不清楚,但是最近几年来有关“动脉粥样硬化是动脉血管壁慢性炎性疾病”的炎症学说得到了大家的认可,积累的证据显示许多炎症因子和免疫细胞参与动脉粥样硬化的发生和发展,即动脉粥样硬化的发生是血管壁细胞与血液细胞在多种炎症因子和致病因子作用下相互作用所导致的一种血管损伤过程。在这一过程中,单核/巨噬细胞介导的固有免疫反应和T细胞介导的适应性免疫反应均发挥重要作用。抑癌基因是一类控制细胞过度增殖并遏制肿瘤形成的基因。近年来发现,很多抑癌基因例如P53,PTEN等不仅与肿瘤的发生发展有密切关系,而且参与了免疫反应和炎性疾病等生理和病理过程。程序性细胞死亡-4(programmed cell death4, PDCD4)是新确定的一种抑癌基因,在人多种肿瘤的发生发展中发挥重要的抑制作用,但在炎性疾病中的作用尚不明确。有限的几篇报道显示PDCD4基因敲除(Pdcd4-/-)小鼠可抵抗自身免疫性疾病——实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和Ⅰ型糖尿病的发生及脂多糖(LPS)诱导的内毒素性休克,提示PDCD4不仅具有抑癌基因的作用,很可能在炎症性疾病中也发挥重要作用。那么,PDCD4是否在动脉粥样硬化的发生与发展中发挥作用呢?发挥何种作用?其作用机制是什么?目前尚不清楚。为了明确PDCD4在动脉粥样硬化中的作用,探索其作用机制,为动脉粥样硬化的临床治疗提供理论证据和实验基础,本论文从以下两个方面进行了研究：一、PDCD4在动脉粥样硬化形成过程中的表达及作用：我们发现随着Apoe-/--小鼠动脉粥样硬化斑块的进展PDCD4在斑块局部的表达逐渐升高,提示PDCD4参与动脉粥样硬化的发生。进一步采用双基因敲除(Pdcd4-/-Apoe-/-)小鼠证明PDCD4的缺失明显减少斑块的形成,说明内源性PDCD4在动脉粥样硬化中发挥促进作用。并且发现PDCD4的缺失影响了T细胞和巨噬细胞在斑块局部的浸润。二、PDCD4对免疫细胞的影响及其在动脉粥样硬化中的作用：首先通过骨髓移植实验证明免疫细胞在PDCD4影响动脉粥样硬化的过程中发挥重要作用。然后体内外试验比较Pdcd4-/-Apoe-/-与Apoe-/-小鼠斑块局部及外周的巨噬细胞和T淋巴细胞及其各亚群的比例,并检测了其分泌细胞因子的改变。我们发现PDCD4的缺失显著升高了IL-10的水平,进一步体内实验证实PDCD4缺失导致的IL-10的升高是斑块减少的一个重要原因。最后我们用RIP实验确定了PDCD4不是通过直接与IL-10mRNA结合从而在翻译水平抑制其表达,而是通过ERK和P38通路在转录水平调控IL-10的表达。研究方法一、PDCD4在动脉粥样硬化形成过程中的表达及作用1. PDCD4在动脉粥样硬化形成过程中的表达(1)用Western blot的方法检测8周龄未高脂、高脂8周(16周龄)和高脂16周(24周龄)的Apoe-/-小鼠血管斑块局部蛋白中PDCD4的表达情况。(2)用免疫组化的方法对斑块局部PDCD4的表达进行细胞定位。2. PDCD4在动脉粥样硬化形成中的作用(1)将Pdcd4-/-小鼠与Apoe-/-小鼠杂交获得双基因敲除小鼠(Pdcd4-/-Apoe-/-)做为实验组,Apoe-/-小鼠做为对照组,给予高脂喂养诱导斑块的形成。(2)高脂喂养8周或16周后,取主动脉根制备冰冻切片,HE、油红O染色及免疫组织化学染色比较Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠主动脉根部斑块大小、脂质沉积、组成成分(平滑肌和胶原)及炎性浸润(T细胞和巨噬细胞)的差别；取主动脉弓及胸腹主动脉,经油红O染色后,解剖显微镜下观察并比较大体解剖斑块数量和面积的差别。二、PDCD4对免疫细胞的影响及其在动脉粥样硬化中的作用：1.骨髓移植实验证明免疫细胞在PDCD4缺失导致动脉粥样硬化减弱过程中发挥主要作用(1)分别收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠股骨和胫骨中骨髓细胞,通过尾静脉注射移植入受致死剂量X射线照射的Ldlr-/-小鼠体内,高脂喂养12周和16周后,分别处死小鼠,主动脉根部制备冰冻切片,HE和油红O染色观察并比较斑块的大小。(2)冰冻切片进行免疫组化染色比较巨噬细胞和T细胞在斑块局部的浸润情况。(3) Western blot的方法检测骨髓移植后高脂喂养2周、12周和16周的Ldlr-/-小鼠血管斑块中PDCD4的表达。2.体内实验研究PDCD4缺失对巨噬细胞和T细胞亚群的影响(1)Pdcd4-/-Apoe-/小鼠和Apoe-/-小鼠高脂喂养8周或16周后,研磨小鼠脾脏,制备脾细胞的单细胞悬液,用流式细胞术的方法检测并比较巨噬细胞和T细胞各亚群(CD4+,CD8+,Th17,Treg)比例的变化,并用直线回归的方法分析其比例与斑块面积大小的相关性。(2)冰冻切片免疫荧光或免疫组化染色比较斑块局部CD4+和CD8+比例的变化。3.体内实验研究PDCD4缺失对巨噬细胞和T细胞相关细胞因子的影响(1)血清中：流式细胞微球芯片试剂盒和ELISA的方法检测并比较Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠高脂喂养后血清中细胞因子(IL-2,IL-4,IL-6,IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-p)的改变,并用直线回归的方法分析细胞因子浓度与斑块面积大小之间的相关性。(2)斑块局部：1)冰冻切片免疫双荧光染色比较斑块局部IL-17和IL-10水平的变化。2)将含有大量斑块的主动脉弓及胸腹主动脉血管组织裂解提取RNA或蛋白,分别用real time PCR或Western blot的方法检测并比较斑块局部细胞因子的改变。4.体外实验研究PDCD4对T细胞功能的影响及其机制(1)对T细胞增殖能力的影响：1)体外培养脾细胞并刺激活化,CCK8试剂盒检测并比较实验组与对照组的增殖情况。2)流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞的增殖情况。3)流式细胞仪分别检测CD4+和CD8+T细胞中协同刺激分子CD28、CD137和协同抑制分子CTLA-4比例的变化。(2)对T细胞分泌细胞因子的影响：流式细胞微球芯片试剂盒检测并比较培养上清中细胞因子的改变。5.体外实验研究PDCD4对巨噬细胞功能的影响：收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞进行体外培养,并用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激不同的时间段使其活化,ELISA的方法检测并比较培养上清中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和抑炎性细胞因子IL-10的浓度。6.体内干预治疗确定IL-17和IL-10在PDCD4缺失减弱动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用：以Apoe-/-小鼠做正常对照,将Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分为三组,高脂喂养4周后分别给予生理盐水、重组IL-17细胞因子和IL-10中和性抗体腹腔注射一周一次,共注射5周,处死小鼠,主动脉根部制备冰冻切片,HE和油红O染色观察并比较斑块的大小。7.分子机制研究探讨PDCD4从翻译水平还是转录水平调控IL-10的表达(1)RNA蛋白结合免疫沉淀试剂盒(RIP)获得与PDCD4结合的全部RNA, real time PCR扩增IL-10,确定PDCD4是否与IL-10mRNA形成复合体从而确定PDCD4是否从翻译水平调控IL-10的表达。(2)提取活化巨噬细胞的总RNA,用RT-PCR的方法检测并比较IL-10在mRNA水平的表达。(3)提取活化巨噬细胞的蛋白,用Western blot的方法检测并比较MAPK (JNK,ERK1/2,P38)信号通路的活化情况,并通过加入信号通路抑制剂后ELISA检测上清中IL-10的表达情况确定PDCD4通过哪条信号传导通路调控IL-10的转录。结果一、PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达与作用1.动脉粥样硬化小鼠模型的建立我们给予8周龄的Apoe-/-小鼠高脂饲料喂养,造成体内高血脂坏境,诱导斑块的形成。分别取8周龄(未高脂)做为无斑块期,16周龄(高脂8周)做为早期斑块期和24周龄(高脂16周)做为晚期斑块期。2. PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达为了明确PDCD4在动脉粥样硬化发展过程中的表达情况,我们分离16周和24周Apoe-/-小鼠富含斑块的主动脉弓及胸腹主动脉裂解蛋白,以8周龄无斑块血管为对照,western blot的方法检测了PDCD4的表达情况,结果显示随着高脂喂养时间的延长(即动脉粥样硬化斑块的发展)PDCD4的表达明显升高。免疫组化染色发现PDCD4主要表达于免疫细胞(巨噬细胞和T细胞),另外,在平滑肌细胞中也有表达,提示PDCD4可能具有促进动脉粥样硬化斑块形成和发展的作用。3. PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用为了研究PDCD4在动脉粥样硬化形成过程中的作用,我们制备了Pdcd4和Aope双基因敲除(Pdcd4-/-Apoe-/-)小鼠,并以此小鼠为实验组,以Apoe-/-小鼠为对照组,研究了PDCD4缺失对动脉粥样硬化形成的影响。结果发现高脂喂养8周或16周后Pdcd4-/-Apoe-/小鼠主动脉根部的斑块和主动脉弓及胸腹主动脉段的斑块较对照组相比,面积均明显减小(p<0.01),脂质沉积减少(p<0.01),局部巨噬细胞和T细胞的浸润都较对照组明显减少(p<0.05)。另外,胶原含量、平滑肌细胞也明显减少(p<0.01)。以上结果说明PDCD4缺失使动脉粥样硬化斑块减小,即PDCD4本身起促进动脉粥样硬化斑块的作用。二、PDCD4对免疫细胞功能的影响及其在动脉粥样硬化中的作用：1.骨髓移植实验证明免疫细胞在PDCD4缺失导致动脉粥样硬化减弱的过程中发挥主要作用已知免疫细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中发挥重要作用,而且PDCD4在斑块局部浸润的巨噬细胞和T细胞中高表达,PDCD4缺失的小鼠斑块局部巨噬细胞和T细胞浸润减少,提示PDCD4可能通过改变免疫细胞的功能发挥作用,故我们进一步利用骨髓移植的方法论证这个问题。我们将C57BL/6(含有野生型PDCD4)和Pdcd4-/-(缺失PDCD4)小鼠的骨髓细胞移植给Ldlr-/-小鼠,并通过高脂喂养诱导斑块的形成。然后取主动脉根制备冰冻切片进行HE和油红O染色,比较斑块面积的大小,发现移植Pdcd4-/-骨髓细胞的Ldlr-/-小鼠斑块面积明显比移植C57BL/6骨髓细胞的斑块减小(p<0.05)。将主动脉弓和胸腹主动脉段在解剖显微镜下剖开,油红O染色,发现移植Pdcd4-/-骨髓细胞的Ldlr-/-小鼠大体解剖斑块面积明显比移植C57BL/6骨髓细胞的斑块数量减少,面积减小(p<0.01)。同时发现移植Pdcd4-/-骨髓细胞的Ldlr-/-小鼠巨噬细胞和T细胞的浸润较对照组明显减轻。我们还用western blot的方法检测了移植后小鼠血管斑块中PDCD4的表达,发现移植Pdcd4-/-骨髓细胞的Ldlr-/-小鼠斑块中PDCD4表达较弱,明显比对照组减少,所以我们认为斑块中PDCD4虽在平滑肌细胞中有所表达,但其主要表达于免疫细胞中。以上结果虽不能排除平滑肌细胞的作用,但可证明免疫细胞在PDCD4缺失减弱动脉粥样硬化发生的过程中发挥着主要作用。2.体内试验发现PDCD4缺失导致CD8+T细胞降低而Treg升高为了进一步研究PDCD4对免疫细胞的影响,我们用流式细胞仪检测了外周免疫器官——脾脏中巨噬细胞(F4/80+)和T细胞各亚群(CD4+,CD8+,Treg)数量的变化,结果发现PDCD4缺失后小鼠脾脏巨噬细胞比例无明显差别,但是CD8+T细胞比例在高脂喂养8周和16周后Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠较对照组都明显降低(p<0.01),CD4+T细胞比例呈降低趋势,其中CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例明显上升(p<0.01),而效应性Th1、Th2和Th17细胞无明显变化。直线回归分析显示CD8+T细胞数量与斑块面积呈正相关,而Treg数量与斑块面积呈负相关关系。进一步斑块局部免疫细胞化学染色证明Pdcd4-/-Aope-/-小鼠斑块局部CD8+T细胞数量占斑块面积的比例较对照组明显减少(p<0.01),而TregCFoxp3+)细胞数量占斑块面积的比例则比对照组明显升高(p<0.05),变化趋势与外周一致。已知CD8+T细胞在动脉粥样硬化的形成过程中起促进作用,而Treg起抑制作用,我们的结果说明PDCD4缺失导致的CD8+T细胞降低和Treg升高可能是斑块减少的原因之一。3.体内实验发现PDCD4缺失导致抑炎性细胞因子IL-10增加而促炎性细胞因子IL-17下降为了研究PDCD4对外周巨噬细胞和T细胞相关细胞因子的影响,我们取高脂喂养16周的Pdcd4-/-AApoe-/-和Apoe-/-小鼠血清,流式细胞微球芯片试剂盒和ELISA的方法分析了多种细胞因子(IL-2,IL-4,IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17,IL-10和TGF-p)的变化,结果显示Pdcd4-/-AApoe-/-小鼠血清中IL-10、IL-6和IFN-γ浓度较对照组升高(p<0.05),而IL-17和TGF-β浓度较对照组降低(p<0.05),其他细胞因子无明显改变。为了确定细胞因子的变化与斑块减小的关系,我们进行了相关性分析,发现促炎性细胞因子IL-17的浓度与斑块面积呈正相关,而抑炎性细胞因子IL-10浓度与斑块的面积呈负相关关系,而IL-6、IFN-γ和TGF-β的浓度与斑块的大小没有明显的相关关系。为了进一步确定PDCD4缺失对细胞因子的影响及与斑块形成的关系,我们采用real time PCR、Western blot、免疫组织化学和免疫荧光等方法检测了斑块局部细胞因子的改变,发现IL-17和IL-10的表达与外周趋势一致,Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑块局部IL-17明显低于对照组(p<0.05),而IL-10明显高于对照组(p<0.01)。与外周不同的是,IL-6在Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑块局部mRNA水平较对照组降低(p<0.05),而TGF-β较对照组升高(p<0.001),其他细胞因子没有明显差别。已知IL-6和IL-17是促炎性细胞因子,具有促进动脉粥样硬化斑块形成的作用；而IL-10和TGF-β是抑炎性细胞因子,具有抑制斑块形成的作用。故PDCD4缺失导致的细胞因子谱的改变可能是PDCD4缺失导致斑块减少的另一个机制。4.体外实验研究PDCD4对T细胞功能的影响及其机制(1) PDCD4缺失导致CD8+T细胞增殖能力降低明确了PDCD4对T细胞亚群数量的影响,为了进一步明确其对T细胞功能的影响,我们取16周Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠的脾脏,制备脾细胞的单细胞悬液进行体外培养,并用CD3抗体刺激T细胞活化。然后用CCK8试剂盒检测培养3天后T细胞的增殖情况,发现Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠脾细胞增殖能力较对照组明显减弱(p<0.001),而用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群比例发现,CD4+T细胞增殖情况无明显差别,而Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠CD8+T细胞增殖后比例较对照组明显减少(p<0.05),说明PDCD4缺失降低了CD8+T细胞的增殖能力。因为T细胞的活化增殖除了抗原提供第一信号外,必须通过协同刺激分子传递第二信号,所以为了明确CD8+T细胞增殖能力的减弱是否由于协同刺激分子表达的改变所致,我们用流式细胞仪检测了CD4+和CD8+T细胞协同刺激分子(CD28和CD137)和协同抑制分子(CTLA-4)的表达,结果显示提供活化信号的CD28和CD137在CD4+T细胞上的表达两种小鼠无明显差别,而在CD8+T细胞上的表达Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠较对照组均明显下降(p<0.05)；提供抑制信号的CTLA-4在CD4+和CD8+T细胞上的表达均较对照组升高(p<0.05)。以上结果提示,Pdcd4缺失引起的CD8+T细胞增殖能力及数量的降低可能由于CD8+T细胞上协同刺激分子CD28和CD137表达下调,而协同抑制分子CTLA-4表达上调导致的。(2) PDCD4缺失导致T细胞分泌IL-17减少我们用流式细胞微球芯片试剂盒检测T细胞培养上清中细胞因子的分泌情况,发现Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠T细胞分泌的IL-17较对照组明显下降(p<0.05),而其他细胞因子均无明显差别,这与之前血清中IL-17浓度的改变趋势是一致的,提示IL-17浓度的降低可能是PDCD4缺失减弱动脉粥样硬化发展的原因之一。5.体外实验发现PDCD4缺失导致巨噬细胞产生高水平的IL-10我们进一步在体外研究了PDCD4对巨噬细胞功能的影响,收集C57BL/6和Pdcd4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞体外培养,并用oxLDL模拟体内高脂环境刺激其活化。分别取刺激6、12、24和48h培养上清,ELISA的方法检测巨噬细胞分泌的细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的浓度,结果显示,除了TGF-β在两种小鼠中无明显差别之外,其余3种细胞因子均为Pdcd4小鼠较对照组升高,但是IL-6和TNF-α浓度在12h达到高峰以后,随时间延长逐渐降低,而IL-10浓度随时间延长持续增加,所以IL-10的抑炎作用可能占主导地位。6.体内干预治疗确定IL-10的上调是PDCD4缺失导致斑块减少的主要原因在我们前期实验研究中,给Apoe-/-小鼠注射重组细胞因子IL-17可以明显加重斑块的发展。为了探讨PDCD4缺失引起的IL-17下降和IL-10增多是否是动脉粥样硬化斑块减小的主要原因,我们采用同样的处理方法,将Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分为3组,分别在高脂喂养5周后腹腔注射生理盐水、重组IL-17细胞因子和IL-10中和性抗体,每周一次,共注射5周,并以Apoe-/-小鼠注射生理盐水做为正常对照。主动脉根部制备冰冻切片,HE和油红O染色比较斑块的大小,结果显示注射IL-17组较注射生理盐水组斑块面积无明显差异,而注射IL-10中和性抗体组较生理盐水组斑块面积明显增加(p<0.05)。以上结果提示,PDCD4缺失引起的IL-10增多是其减弱动脉粥样硬化斑块的主要机制。7.分子机制研究证明PDCD4主要在转录水平发挥对IL-10的负调控作用为了探讨PDCD4是否在翻译水平调控IL-10的表达,首先采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation, RIP)的方法检测活化的巨噬细胞中PDCD4是否与具有5’UTR二级结构的IL-10mRNA形成复合体从而抑制IL-10的翻译,结果发现PDCD4与IL-10mRNA不结合,即PDCD4不影响IL-10的翻译,故我们认为PDCD4是从转录水平调控IL-10的表达。然后,我们从mRNA水平研究PDCD4对IL-10表达的调控。分别取刺激3、6和12h的巨噬细胞提取其RNA,用RT-PCR的方法检测IL-10在mRNA水平的表达,发现Pdcd4-/-巨噬细胞产生的IL-10在mRNA水平上的表达明显较对照组升高,提示PDCD4在转录水平调节IL-10的表达。为了明确PDCD4的缺失通过改变了哪条信号传导通路从而增加了IL-10的转录,我们用western blot的方法检测了分别刺激6、12和24h的巨噬细胞产生IL-10的转导信号通路(MAPK通路)分子的表达情况,结果显示磷酸化活化的JNK在两种小鼠中无明显差别,而ERK1/2和P38的磷酸化活化在Pdcd4-/-小鼠中较对照组明显升高。为了明确这两条通路的作用,我们在刺激巨噬细胞活化的同时分别添加ERK1/2和P38抑制剂,结果IL-10产生明显下降。以上结果提示Pdcd4缺失可能通过增加ERK1/2和P38的磷酸化活化从而导致IL-10的产生增加。结论1. PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成和发展过程中表达上调。2. Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑块面积减小,斑块局部巨噬细胞和T细胞浸润减少。3.通过骨髓移植实验证实了免疫细胞在PDCD4缺失减弱动脉粥样硬化的过程中起主要作用。4.外周和斑块局部CD8+T细胞比例减少,而Treg比例升高；促炎性细胞因子IL-17浓度降低,而抑炎性细胞因子IL-10浓度增加。5. PDCD4缺失CD8+T细胞增殖能力下降,可能是通过下调协同刺激分子CD28和CD137,而上调协同抑制分子CTLA-4实现的。6. PDCD4缺失巨噬细胞分泌IL-10增加。7.体内试验证明IL-10增加是PDCD4缺失后斑块减小的主要原因。8. PDCD4不影响IL-10的翻译,可能是通过ERK和P38通路从转录水平调控1L-10的表达。创新性和研究的意义1.首次证明抑癌基因PDCD4具有促进动脉粥样硬化发生的作用：我们发现Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化斑块发展过程中PDCD4表达上调,Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积减小。本研究为以PDCD4为靶点临床治疗动脉粥样硬化提供了理论基础和实验根据。2.通过骨髓移植实验确定了免疫细胞在PDCD4影响动脉粥样硬化中的作用。首次提出PDCD4可引起巨噬细胞和T细胞亚群数量和功能的改变。3.我们通过体内试验证明了PDCD4缺失导致的IL-10增加是Pdcd4敲除小鼠动脉粥样硬化斑块减弱的主要原因。发现PDCD4不影响IL-10的翻译水平,而是通过ERK和P38通路从转录水平调控IL-10的表达；此研究不仅明确了PDCD4影响动脉粥样硬化的作用机制,而且为动脉粥样硬化的治疗提供了新的靶点。局限性1.由于技术的限制,本论文仅使用敲基因小鼠做为研究对象,没有在PDCD4过表达体系中验证结果。2.由于时间的关系本研究重点研究了PDCD4影响动脉粥样硬化发生的免疫机制,对平滑肌细胞的迁移、增殖等功能的影响有待进一步探讨。