项目团队90年代创新研制的一代抗肿瘤免疫核糖核酸（antitumor immune ribonucleic acid,AT-iRNA）是应用肿瘤抗原免疫动物后,从免疫器官提取出来的总RNA。一代核酸可激发肿瘤患者对肿瘤细胞的体液免疫和细胞免疫能力,临床长时间及大样本应用证实对手术切除原发灶患者具有控制转移、清除残余癌细胞作用,对多种恶性肿瘤等均有较好的疗效。但近十几年来,抗肿瘤免疫核糖核酸的产销量急剧下降。主要原因是iRNA自身性质不稳定很容易被RNA酶降解;所产生的免疫力尚不够强,特异性不高,在应用中效果不佳,且价格相对昂贵。一代核酸生产技术的瓶颈问题包括:（1）制备肿瘤抗原的工艺极其粗糙,导致肿瘤抗原纯度大幅度减低,（2）抗肿瘤iRNA提取流程简单,无保护活性iRNA程序,导致大量iRNA降解,（3）活性RNA含量甚微（3~5%）,严重制约了抗肿瘤免疫治疗的药效学作用,（4）一代抗肿瘤iRNA的药效学机制不清楚。针对上述问题,本研究在国内外应用分子技术的创新集成,率先研发新一代抗肿瘤免疫核糖核酸专利制备工艺。本研究针对AT-iRNA中活性mRNA含量较少,从而影响治疗效果的问题出发,结合mRNA体外整体扩增技术,参照RNA疫苗制备研究中mRNA整体扩增流程,建立针对AT-iRNA中mRNA大量扩增的技术,并通过体内外实验验证了扩增的mRNA具有的抗肿瘤活性。本研究取得成果如下:1.证实了纯化的肿瘤组织细胞抗原的免疫效果高于肿瘤组织免疫原。应用组织酶消化与差速离心法从肝癌组织分离纯化肝癌细胞,通过超声获取肝癌细胞与肝癌组织蛋白。将上述两组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过ELISA测定小鼠血浆抗肿瘤抗原的免疫效价,Trizol提取小鼠脾脏的总RNA,应用凝胶电泳与紫外测定提取RNA的完整性与含量。实验结果显示:（1）分离纯化的肝癌细胞蛋白抗原免疫的动物获得血清抗肿瘤效价与明显优于肝癌组织直接提取蛋白抗原,（2）肝癌细胞蛋白免疫动物的脾细胞抗肝癌的活性高于肝癌组织直接提取蛋白抗原组。（3）提取的RNA电泳显示了提取RNA具有完整性,提取的RNA含量在150μg/只脾左右,OD260/OD280在1.8-2.0之间。2.成功建立了免疫活性RNA（mRNA）体外整体扩增的技术免疫小鼠获取的脾细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA,在逆转录过程中,（1）设计12种与mRNA POLY（A）结合的寡核苷酸序列,保证总RNA中所有的具有POLY（A）mRNA得以逆转录,并包含一段公用引物,用于下一步cDNA扩增（2）寡核苷酸Cap,包含T7RNA聚合酶的启动子序列与转换序列GGG。针对逆转录获得cDNA,应用通用引物及长片段扩增PCR反应试剂进行所有cDNA同步扩增,扩增后的DNA应用电泳进行观察,紫外检测DNA含量。以扩增的cDNA为模板,应用T7体外RNA转录反应体系进行整体RNA的转录,转录的RNA通过紫外检测含量。选择GAPDH、Actin、IFG-γ等基因,根据基因序列分别设计目的片段长度为179 bp、987 bp、1424 bp的引物,分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后分别进行实时荧光定量PCR检测,产物进行凝胶电泳。通过观察Ct值以及电泳条带的亮度、位置,判断整体扩增的mRNA的完整性。通过RNA含量计算mRNA扩增效果。实验结果显示（1）4ng逆转录cDNA经过体外扩增,扩增产物纯化后的电泳显示不同长度片段扩增产物产生,含量测定为2.5μg,扩增效率为625倍。（2）在体外转录的模板是cDNA100ng,最终最多扩增的数量是13μg,扩增100多倍。（3）分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后通过实时荧光定量PCR法检测GAPDH等内参基因以及IFN-γ等的基因的表达。通过Ct值应用相对定量法计算这些基因经过整体扩增后的扩增倍数。结果表明与原始iRNA相比,扩增后的AT-iRNA中GAPDH、IFN-γ等基因得到有效扩增,倍率200倍~1200倍不等,不仅说明了体外扩增工艺的保真性,而且基因mRNA绝对含量显著增加。3.体内外实验证实新型抗肿瘤核糖核酸具有显著的抗肿瘤生物学作用在体外研究中分离获取人外周血单个核细胞,分别将扩增的核糖核酸与未扩增的RNA作用于外周血单个核细胞,将刺激的细胞作用于人肝癌细胞株,通过CCK-8检测细胞的活性,应用ELISA方法检测免疫细胞上清的IFN-γ的含量。制备小鼠肝癌细胞荷瘤动物模型,分别给予商品化的抗肝癌免疫RNA、扩增的核糖核酸（低剂量与高剂量）,通过观察肿瘤细胞重量与体积判断肿瘤生长的抑制情况,HE染色观察肿瘤组织细胞活性情况,流式细胞术检测淋巴细胞表型变化,实时定量PCR检测肿瘤凋亡相关基因表达与免疫细胞相关细胞因子的表达。实验结果显示（1）体外实验显示在原始iRNA刺激后的淋巴细胞抑制肿瘤生长率为50.23%,在新型AT-iRNA刺激后的淋巴细胞抑制肿瘤生长率为60.08%,与单纯淋巴细胞组相比具有明显差异p<0.05,而新型AT-iRNA组与原始组之间无显著差异,说明通过扩增后的新型AT-iRNA达到与原始iRNA同样的抑制肿瘤效果。体外肿瘤杀伤实验证实新型AT-iRNA具有诱导人外周血淋巴细胞肿瘤杀伤作用。（2）IRNA刺激的淋巴细胞细胞上清中有效分泌干扰素γ,AT-iRNA刺激组明显高于原始iRNA。（3）与荷瘤小鼠和使用一代核酸组相比,使用150μg新型AT-iRNA进行抗肿瘤治疗的小鼠,其肿瘤体积在治疗后期呈明显下降趋势,肿瘤体积和肿瘤重量显著低于荷瘤组.。（4）HE染色观察达到150μg新型AT-iRNA组具有明显的细胞死亡,流式细胞术结果检测的细胞CD4,CD8.CD56.CD62L表达未见明显表达差异。（5）实时定量PCR结果显示,与使用一代核酸组相比,使用150μg新型AT-iRNA进行抗肿瘤治疗的小鼠,肿瘤细胞内Bcl2、Casp3的相对表达水平均显著降低,Bax、Trp53的相对表达增加。这一结果提示,AT-iRNA抗肿瘤的作用机制可能为抑制癌症相关基因的表达水平,从而抑制肿瘤细胞的恶性生长。脾组织中免疫相关基因TNF、IFN-γ、IL12A、IL12B均明显下调。说明该新型AT-iRNA在体内可能不是通过免疫细胞杀伤肿瘤,其机制需进一步研究。总之本研究在国内外率先将分子扩增的创新技术引入抗肿瘤iRNA制备工艺,通过联合分子技术的创新集成优势,在我国率先建立基于分子技术创新集成优势的抗肿瘤免疫iRNA制备技术,通过肿瘤细胞特异分离技术大幅度提高免疫动物肿瘤细胞抗原的纯度与免疫原性,通过抗肿瘤mRNA体外整体扩增,取代传统的单纯提取技术,使抗肿瘤活性RNA（mRNA）得到几何级数的扩增。长期保存患者个体化抗肿瘤免疫mRNA,获得高效而特异地抗肿瘤免疫iRNA永久性资源,通过小动物即可获得大量的抗肿瘤免疫核糖核酸,极大地降低抗肿瘤iRNA的生产成本,,为肿瘤免疫治疗提供新的方法。