杜仲总黄酮对脂多糖诱导BV-2神经炎症的影响及其机制研究

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与神经炎症相关的神经退行性疾病愈发常见,开发具有神经炎症抑制作用的药物或保健食品成为当前研究热点。杜仲(Eucommia ulmoides)作为重要的药食同源植物,具有降压、降脂、抗肿瘤等功效,是很好的药物和保健食品开发原料。黄酮是杜仲的重要成分之一,大量存在于杜仲叶与杜仲雄花中,具有抗炎、抗氧化与中枢神经保护作用,但目前杜仲总黄酮对于神经胶质细胞活化引起的神经炎症的抑制研究尚不多见。本课题以成熟期杜仲叶(EL Mature)、幼年期杜仲叶(EL Young)和杜仲雄花(EF Male)为研究对象,探索了杜仲总黄酮的超声提取工艺、成分含量对比与体外抗氧化活性;利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导建立神经炎症细胞模型,研究了三种杜仲黄酮提取物对于LPS诱导的BV-2细胞神经炎症反应的影响,探索了杜仲叶黄酮对于神经炎症的作用机制;结合黄酮包合与黄酮乳剂制备,为预防或改善由神经炎症引发的相关疾病提供新思路。本研究主要结果如下:研究首先通过提取单因素实验与正交试验考察了各提取因素(料液比、乙醇浓度、提取时间、提取次数),确定了杜仲总黄酮超声提取的最佳工艺为杜仲叶干粉与乙醇料液比1:12、超声提取20 min、乙醇浓度60%、p H值为4、超声提取3次。后经NKA-II极性大孔树脂分离纯化,使EL Mature黄酮、EL Young黄酮和EF Male黄酮提取物的纯度分别由(5.58±0.1)%、(21.29±0.14)%、(10.06±0.02)%提升至(41.36±0.19)%、(61.64±0.14)%、(52.37±0.47)%。采用液质联用技术,对比分析三种杜仲总黄酮提取物中的儿茶素、表儿茶素、芦丁、木犀草素、槲皮素、山奈酚、柚皮素、槲皮苷、紫云英苷、金丝桃苷、异槲皮素、黄芩素的成分含量。经检测三种杜仲黄酮提取物中均含有十二种主要黄酮成分,其中芦丁、槲皮苷、紫云英苷和金丝桃苷、异槲皮素含量较高;除黄芩素外,EL Young黄酮提取物中的黄酮类化合物含量均高于另外两种杜仲黄酮提取物,可见EL Young中的主要黄酮类化合物含量高于EL Mature与EF Male。应用自由基清除能力检测试剂盒,检测杜仲黄酮体外氧自由基清除能力,发现三种杜仲总黄酮提取物均具有DPPH、-OH、O2-清除能力,且清除能力与杜仲总黄酮浓度呈正相关。利用LPS刺激BV-2细胞构建神经炎症模型,以CCK-8法测定不同浓度的黄酮提取物对正常BV-2细胞的活力影响,结果表明三种杜仲总黄酮提取物浓度在100μg/m L-600μg/m L时,BV-2细胞存活率达到80%以上,基本不产生毒性。利用ELISA、Western Blot法检测三种黄酮提取物在200μg/m L、400μg/m L、600μg/m L药物浓度作用下细胞炎症因子与炎性蛋白表达水平,结果表明三种杜仲黄酮提取物均可显著降低细胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子(p<0.05)与BV-2细胞中i NOS、COX-2蛋白表达(p<0.01),在一定程度上抑制LPS诱导的BV-2细胞活化。利用Western Blot法检测LPS诱导的BV-2内NF-κB、MAPK信号通路中p-IκB、IκB、p-p65、p65、p-p38、p38、p-JNK、JNK蛋白表达水平,结果显示,三种杜仲黄酮提取物均能够降低细胞中IκB、p65、p38和JNK蛋白的磷酸化水平(p<0.05),进而抑制NF-κB信号通路与MAPK信号通路激活,缓解LPS对于BV-2细胞的致炎作用。另外,在同等药物浓度下,EL Young黄酮提取物的炎症抑制效果明显优于另外两种黄酮提取物。利用LPS刺激BV-2细胞构建神经炎症模型,设置LPS组(LPS 1μg/m L)、ELM组(EL Mature 600μg/m L+LPS 1μg/m L)和ELY组(EL Young 600μg/m L+LPS 1μg/m L),利用转录组测序(RNA-Seq)技术探究杜仲叶黄酮发挥炎症抑制作用的分子机制与信号通路信息。分析显示,ELM组对比LPS组与ELY组对比LPS组筛选出共同差异基因993个,其中显著差异基因编码的蛋白多参与机体免疫功能、膜受体、神经发育等相关功能或生物途径。KEGG富集分析显示,两种杜仲叶黄酮对神经炎症作用机制相似,均能下调BV-2细胞中的MAP3K5、FOS、JUN、Tlr2、Tlr4、Tlr7、Tlr8、JAK1和JAK2等上游炎症相关基因的表达,抑制TNF-α/PI3K-Akt/MAPK/TLR4/NF-κB等多条与神经系统炎症相关的信号通路过度激活,从而发挥神经系统炎症抑制作用。实验以羟丙基-β-环糊精为包合材料,通过单因素实验、正交试验考察各因素(投料比、包合温度、搅拌时间、搅拌速度),确定了杜仲总黄酮包合最优工艺为羟丙基-β-环糊精与杜仲总黄酮质量比为2:1、包合温度20℃、搅拌3小时、搅拌速度为300 rpm。通过包合的黄酮溶液相比杜仲黄酮水溶物,黄酮浓度提升了42.62%。再通过单因素实验、响应面实验考察各因素(油水比、p H值、均质压力、均质次数),进行黄酮乳剂制备工艺参数的初步优化。结果表明以花生油为油相,杜仲总黄酮-羟丙基-β-环糊精包合物水溶液为水相,油水比3%,p H值为7,均质压力70 kpa,均质7次杜仲总黄酮乳剂稳定性较好。通过黄酮包合与杜仲黄酮乳剂可提升口服黄酮的水溶解度和稳定性。总之,本文以成熟期杜仲叶、幼年期杜仲叶和杜仲雄花为研究对象,从杜仲总黄酮的提取与检测入手,为杜仲的合理采摘与提取利用提供了理论依据。探索了杜仲幼叶、杜仲成熟叶和杜仲雄花总黄酮对于BV-2细胞活化引发的神经炎症的干预作用与作用机制,并结合黄酮包合与杜仲黄酮乳剂制备,为开发预防或改善由神经炎症引发的相关疾病药物提供了数据支撑和理论依据。
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