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背景和目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最严重的微血管并发症,已经成为了终末期肾病（End-Stage Renal Disease,ESRD）的重要病因,但其发病机制复杂,目前尚未阐明。课题组与其他学者的研究表明巨噬细胞介导的炎症与DN的疾病进程密切相关。但巨噬细胞除了产生传统的促炎介质外,还是否还有其它方式加重肾脏损伤在近年也引起极大关注。外泌体是一种直径40~150nm的细胞外囊泡,广泛存在于血清、唾液、尿液和乳汁等人体体液中。外泌体可以通过携带多种信息物质进入受体细胞,并影响受体细胞的功能,完成细胞间的信息交换。近来年,关于外泌体通过携带mi RNA影响细胞功能的研究也越来越多。mi RNA是一种小分子单链RNA,可以通过与靶m RNA结合进而抑制其转录及转录后调控。已经有大量的研究证实外泌体可以携带mi RNA进入靶细胞,影响靶细胞的生物学功能。课题组前期研究证实DN进展过程中巨噬细胞可以释放外泌体,不仅促进其自身活化,还可以被肾小球系膜细胞摄取,导致其细胞外基质分泌增加。近年来研究表明肾小管上皮细胞损伤在DN发病中的地位更加突出,其损伤机制研究是该领域热点之一。在DN的早期,高血糖的微环境就会导致小管细胞增生肥大、有机离子转运减少等病变,并随着疾病进展最终发展成为不可逆的纤维化。而这其中,自噬的稳态对肾小管功能的维持有着极其重要的作用。自噬是一种生理学机制,通过溶酶体吞噬损伤或老化的细胞器,来维持细胞器的更新和内环境的稳态。自噬过度或者自噬不足都会导致细胞内环境稳态的破坏,引起细胞炎症和损伤。已有研究发现,DKD（Diabetic kidney disease）小鼠和2型糖尿病肾病患者的肾小管上皮细胞自噬活性均受到抑制,且自噬相关基因Atg7的缺失会导致糖尿病小鼠肾脏的自噬缺陷,引起更加严重的肾脏肥大、肾小管损伤、炎症、纤维化以及蛋白尿。在此基础上,本研究旨在探索高糖刺激的巨噬细胞源外泌体对肾小管上皮细胞及小鼠肾脏功能、炎症及自噬活性的影响作用和具体机制。方法:第一部分:1、通过将RAW264.7与m TEC进行共培养,并应用外泌体释放抑制剂GW4869来观察巨噬细胞对肾小管上皮细胞的影响作用;通过BCA定量检测各组巨噬细胞源外泌体的浓度,ELISA检测各组培养上清中炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的表达,RT-PCR检测各组小管细胞TNF-α、IL-1β、MCP-1、KIM-1、Col-I和FN的表达变化;2、分别提取正常糖及高糖刺激下巨噬细胞衍生的外泌体,通过电镜观察外泌体形态及BCA定量检测浓度,WB检测外泌体标志物Alix、CD63和TSG101表达,PKH67标记外泌体后并观察m TEC对外泌体的摄取,NTA从测定外泌体粒径分布及浓度;3、通过设置不同的浓度及时间梯度,筛选外泌体刺激m TEC的最佳浓度及时间,并将各组外泌体与m TEC共孵育,通过WB及免疫荧光观察各组细胞KIM-1、Col-I和FN的表达变化,ELISA和RT-PCR检测各组培养上清中和细胞内炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的表达变化,WB检测各组细胞内自噬相关蛋白LC3及p62的表达变化,免疫荧光检测各组细胞中p62的表达变化,电镜观察各组细胞内自噬小体的数量变化;4、将外泌体通过尾静脉注射到C57小鼠体内,检测小鼠一般指标和血清肌酐、尿素氮变化,通过HE及PAS染色观察各组小鼠肾脏中肾小管损伤变化,RT-PCR和免疫组化观察各组小鼠肾组织炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1变化,免疫组化观察各组小鼠肾脏KIM-1、Col-I、FN和p62的表达变化,WB观察各组小鼠KIM-1、Col-I、FN、LC3和p62的表达变化。第二部分:1、提取正常糖及高糖刺激的巨噬细胞源外泌体进行mi RNA高通量测序,筛选差异表达最明显的mi RNA后进行验证,并通过生信分析寻找其下游靶基因;2、通过Targetscan网站预测mi R-7002-5p与Atg9b的结合区域,通过转染mi RNA mimic及inhibitor进入小管细胞,RT-PCR观察各组细胞内mi R-7002-5p与Atg9b的表达水平变化,双荧光素酶报告验证mi R-7002-5p与Atg9b的直接结合;3、RT-PCR检测HG-exo刺激后m TEC内的mi RNA表达变化,WB检测细胞内Atg9b的蛋白表达变化,荧光原位杂交观察各组细胞及小鼠肾脏中mi R-7002-5p的表达变化;4、通过mi RNA抑制物inhibitor来减少外泌体内mi R-7002-5p表达,并通过ELISA及RT-PCR观察各组培养上清及细胞内炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的表达变化,WB检测各组细胞内KIM-1、Col-I、FN、Atg9b、LC3和p62的表达变化,激光共聚焦检测各组细胞内p62的表达变化,电镜观察各组细胞内自噬小体的数量变化;5、通过尾静脉注射将各组外泌体打入C57小鼠体内,检测小鼠一般指标和血清肌酐、尿素氮变化,HE及PAS染色观察小鼠肾脏病理学改变,RT-PCR和免疫组化检测各组小鼠肾脏炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1表达变化,免疫组化检测各组小鼠肾脏KIM-1、Col-I、FN的表达变化。结果:第一部分:1、BCA定量结果显示,外泌体抑制剂GW4869可以减少高糖刺激的巨噬细胞源外泌体释放;ELISA结果显示,巨噬细胞外泌体释放抑制后可以减少共培养条件下m TEC细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的表达;RT-PCR结果显示,巨噬细胞外泌体释放抑制后可以减少共培养条件下m TEC细胞内炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1及功能标志物KIM-1、Col-I、FN的m RNA水平表达;2、电镜下观察到两组外泌体呈双层膜样结构,形态不一,直径约100nm;WB结果显示,两组外泌体内标志物CD63、TSG101及Alix表达阳性;BCA定量的结果发现,HG-exo组外泌体释放量明显高于NG-exo组;NTA的结果显示,外泌体粒径分布高峰在100nm左右,并且HG-exo组浓度高于NG-exo组;PKH67结果显示,外泌体颗粒可以被m TEC摄取并分布于细胞质中;3、WB结果显示HG-exo的刺激浓度在60μg/m L及刺激时间在36小时时,KIM-1、Col-I、FN的表达最明显;WB和免疫荧光的结果证实HG-exo组内KIM-1、Col-I和FN表达增加;ELISA和RT-PCR的结果显示,HG-exo组细胞炎症因子表达明显升高;WB结果显示HG-exo组细胞内LC3-II表达减少,p62累积增加,免疫荧光结果进一步证实了HG-exo组细胞内p62表达上升,电镜结果显示HG-exo组细胞内自噬小体数量减少;4、动物实验结果显示各组小鼠肾脏/体重比无明显差异,但HG-exo组小鼠血清肌酐、尿素氮水平明显上升;HE和PAS染色结果显示,HG-exo组小鼠肾小管损伤增加,小管损伤指数明显升高,RT-PCR和免疫组化的结果显示,HG-exo组小鼠肾脏内炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1表达增加;WB结果显示,HG-exo组小鼠肾脏内KIM-1、Col-I、FN和p62表达增加,LC3-II表达减少,免疫组化结果显示HG-exo组小鼠肾脏内KIM-1、Col-I、FN和p62表达增加。第二部分:1、通过对正常糖和高糖刺激巨噬细胞释放的外泌体进行高通量测序后,找到差异明显的mi RNA共180条,其中上调的共49条,下调的共131条;通过RT-PCR对上调前8位的mi RNA进行验证后发现,差异表达最明显的是mi R-7002-5p;通过KEGG通路富集分析后发现,Atg9b可能是mi R-7002-5p的靶基因;2、通过Targetscan网站预测mi R-7002-5p与Atg9b的结合区域;RT-PCR结果显示,将mi R-7002-5p mimic转染进入m TEC后,细胞内mi RNA水平明显增加,并且转染inhibitor后,mi RNA表达减少;WB和RT-PCR结果显示,mi R-7002-5p mimic组中Atg9b表达较NC组明显下降,并且转染mi R-7002-5p inhibitor后,Atg9b表达上升;双荧光素酶报告结果显示,WT+mi R-7002-5p组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光比值较其他组明显降低;3、通过外泌体刺激m TEC后,RT-PCR及荧光原位杂交结果显示,HG-exo组细胞内mi R-7002-5p表达增加,且主要分布在胞质内,并且HG-exo组小鼠肾脏中mi R-7002-5p表达增加,且主要分布于肾小管;WB结果显示HG-exo组细胞内Atg9b表达减少;4、RT-PCR结果显示,转染inhibitor后,巨噬细胞及其衍生的外泌体内mi R-7002-5p均明显下降;ELISA及RT-PCR结果显示,HG-inhib-exo组细胞内炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1表达较HG-exo组下降;WB结果显示,HG-inhib-exo组细胞内KIM-1、Col-I、FN和p62的表达较HG-exo组增加,Atg9b和LC3-II的表达明显降低;免疫荧光的结果显示,HG-inhib-exo组细胞内KIM-1、Col-I、FN和p62的表达较HG-exo组增加;细胞电镜结果显示,HG-inhib-exo组细胞内自噬小体数量较HG-exo组明显增加;5、动物实验结果显示各组小鼠的肾重体重比未见明显差异,而HG-inhib-exo组小鼠血清肌酐和尿素氮水平较HG-exo组明显下降,免疫组化及RT-PCR结果显示,HG-inhib-exo组小鼠肾脏炎症因子TNF-α、IL-1β及MCP-1较HG-exo组明显下降;HE及PAS结果显示,HG-inhib-exo组小鼠肾脏损伤较HG-exo组减轻;免疫组化结果显示HG-inhib-exo组小鼠肾脏KIM-1、Col-I和FN表达较HG-exo组明显下降。结论:1、高糖可以诱导巨噬细胞源外泌体释放增加,并且在抑制巨噬细胞的外泌体释放后,可以有效减轻共培养环境下其对于肾小管上皮细胞的损伤及炎症作用;2、HG-exo可以诱导肾小管上皮细胞及C57小鼠的肾小管损伤、细胞外基质的累积以及炎症增加,并且诱导其自噬活性下降;其机制是通过mi R-7002-5p/Atg9b通路发挥作用;3、mi R-7002-5p inhibitor可以减轻HG-exo引起的小管上皮细胞自噬抑制,并减轻小管细胞及C57小鼠肾脏的损伤和炎症。