ε-聚赖氨酸—乳清蛋白复合物的构建、抑菌机理及其分子动力学模拟的研究

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近年来,消费者对“天然”和“最低限度加工”食品的追求,使得天然防腐剂的开发与利用方兴未艾,已成为当今食品科学领域新的研究热点。ε-聚赖氨酸由于具有高效和广谱的抑菌特性,目前已被包括我国在内的多个国家批准作为食品防腐剂。然而,ε-聚赖氨酸在实际应用中却遇到了诸多瓶颈,例如,ε-聚赖氨酸易与食品体系中的大分子(如阴离子多糖或蛋白质等)发生相互作用,导致其在富含蛋白质食品中的最适添加量远远高于其在淀粉类制品中的最适添加量,而过多的添加量会给产品带来涩味,同时也会提高产品的成本。静电复合物体系能够缓解ε-聚赖氨酸对食品理化性质的影响,同时保留ε-聚赖氨酸的抗菌活性,从而解决ε-聚赖氨酸在食品应用中遇到的瓶颈。因此,研究如何解决上述问题,关键在于理解ε-聚赖氨酸静电复合物体系的本质与规律,揭示ε-聚赖氨酸静电复合物体系结构与其抑菌特性的关系。因此,本论文以ε-聚赖氨酸和乳清蛋白为研究对象,研究了ε-聚赖氨酸和乳清蛋白复合体系的构建及其抑菌特性和机制。主要研究工作和结论如下:1.以ε-聚赖氨酸和乳清蛋白为研究对象,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的质量比、p H和离子浓度对ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物浊度、粒径、Zeta电位和稳定性的影响。结果如下,(1)复合物的浊度和粒径与ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度呈线性关系,线性关系说明ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度的增加不会改变体系的相行为,其公式分别为y=0.0501*x+0.0025和y=41.3075*x+390.7667;体系的Zeta电位始终大于20 m V,其和ε-聚赖氨酸-乳清蛋白浓度不存在显著性的关系;(2)ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比对复合物的影响可分为四段,当质量比为0-0.01时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位小于-20 m V,稳定性指数(TSI)小于20;当质量比为0.01-0.1时,复合物的浊度和粒径剧增,Zeta电位为-20至0 m V,TSI大于20;当质量比为0.1-0.5时,复合物的浊度和粒径剧减,Zeta电位为0至20 m V,TSI大于20;当质量比为0.5-1时,复合物的浊度和粒径再次保持稳定,Zeta电位大于20 m V,TSI小于20;(3)p H能够改变复合物的Zeta电位,Zeta电位的改变能够影响复合物间的静电排斥力,从而导致体系浊度和粒径发生改变;同时,体系存在一临界p Hc值,当体系p H小于p Hc值时,复合物的Zeta电位为正值,当体系p H大于p Hc值时,复合物的Zeta电位为负值;p Hc值和ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比呈对数关系,其公式为y=1.7906*log10x-0.0069+8.0448;(4)钠离子浓度对复合物的影响可分为三段,当浓度为0-40 m M时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位大于13.5 m V;当浓度为40-100 m M时,钠离子能够破坏体系中ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的动态平衡,从而导致复合物浊度和粒径剧增,Zeta电位为6.5至13.5 m V;当浓度为100-200 m M时,钠离子能够提供额外的静电斥力来维持复合物的稳定性,从而导致复合物浊度和粒径停止增长并保持稳定,Zeta电位小于6.5 m V;(5)钙离子浓度对复合物的影响可分为四段,当浓度为0-20 m M时,复合物的浊度和粒径保持稳定,Zeta电位大于15.7 m V;当浓度为20-60m M时,钙离子能够破坏体系中ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用的动态平衡,导致复合物浊度和粒径剧增,Zeta电位为7.4至15.7 m V;当浓度为60-100 m M时,钙离子会引起复合物体系的解离,从而导致复合物浊度和粒径剧减,Zeta电位为4.3至7.4 m V;当浓度为100-200 m M时,复合物的浊度和粒径再次保持稳定,Zeta电位小于4.3 m V。2.基于荧光光谱、紫外光谱、红外光谱、扫描电子显微镜、流变仪和质构仪等手段,研究ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用以及ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的结构。结果如下,(1)在ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用过程中,ε-聚赖氨酸对乳清蛋白的荧光猝灭类型为静态猝灭;(2)在红外光谱中,复合物在1750 cm-1处出现一新的特征峰,其对应于C=O的振动,这可能是ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用(氢键)导致C=O基团发生了偏移;(3)ε-聚赖氨酸、乳清蛋白和复合物具有不同的表面形态:ε-聚赖氨酸表面呈海绵状,乳清蛋白呈球形,复合物表面粗糙且形状不规则;(4)复合物仍具有凝胶能力,其凝胶温度依赖于ε-聚赖氨酸-乳清蛋白的浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比、p H和离子浓度:ε-聚赖氨酸-乳清蛋白的浓度、ε-聚赖氨酸和乳清蛋白质量比能够降低复合物的凝胶温度;复合物易于在碱性环境(p H≥7)和强酸环境(p H≤2)中形成凝胶;钠离子能够降低复合物的凝胶温度,而钙离子则会造成复合物凝胶温度的升高;(5)复合物凝胶的硬度和咀嚼性与乳清蛋白浓度呈正相关关系,而弹性呈负相关关系;复合物凝胶的硬度、弹性、内聚力和咀嚼性与ε-聚赖氨酸-乳清蛋白质量比呈负相关关系;在碱性p H值(7-9)中,复合物凝胶的硬度、弹性、内聚力和咀嚼性与p H呈正相关关系;复合物凝胶的硬度和咀嚼性与钠离子浓度呈正相关关系,与钙离子浓度呈负相关关系。3.基于分子动力学模拟技术,研究ε-聚赖氨酸和乳清蛋白(α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的相互作用机制。结果表明,在ε-聚赖氨酸和乳清蛋白相互作用过程中,涉及的相互作用主要为范德华相互作用、盐桥、静电作用、氢键、亲水作用等。其中,静电相互作用是相互作用的主要驱动力,盐桥、氢键和疏水作用则维持相互作用后复合物构象的稳定。在ε-聚赖氨酸中,肽键上羰基的氧原子和氨基是参与相互作用的主要原子和基团。在乳清蛋白中,GLU和ASP是参与相互作用的主要基团,其对相互作用结合自由能的贡献最大,而ARG和LYS则阻碍ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用。其原因在于,GLU和ASP侧链上COO-可以作为氢键受体与ε-聚赖氨酸形成氢键,而ARG和LYS侧链上的NH4+与ε-聚赖氨酸具有相同的电荷,从而导致两者产生相互排斥。4.以大肠杆菌(革兰氏阴性菌)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)为研究对象,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物的抑菌特性。结果表明,ε-聚赖氨酸和乳清蛋白的相互作用并没有导致复合物失去相应的抑菌功能。复合物保留着与ε-聚赖氨酸同等的抑菌功能,其抑菌活性和复合物中ε-聚赖氨酸浓度呈正相关关系。复合物对杆菌(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)的抑菌效果优于对球菌(金黄色葡萄球菌)的抑菌效果。在抑菌过程中,复合物能够通过静电相互作用结合到细菌膜表面,从而造成细菌膜出现孔洞,扰乱细菌的新陈代谢,最终导致细菌裂解死亡。在冷鲜肉抑菌实验中,复合物和ε-聚赖氨酸表现出同等的抑菌效果,复合物的抑菌特性在实际应用中并没降低或受到抑制。5.基于分子动力学模拟技术,研究ε-聚赖氨酸-乳清蛋白复合物在细菌单层膜(POPG)和双层膜(POPE/POPG)中的抑菌机制。单层膜研究结果表明,复合物具有结合到单层POPG膜表面的能力,这是其具有抑菌能力的原因。复合物和单层POPG膜的相互作用主要为氢键、盐桥、静电相互作用和范德瓦尔斯力等,ε-聚赖氨酸肽键中的氨基是复合物参与相互作用的主要位点,而肽键中的氧原子并未参与相互作用。最终,复合物中的ε-聚赖氨酸分子能够稳定在单层POPG膜的头基和甘油酯区域,从而导致细菌膜的流动性增强,有序度变差,有利于ε-聚赖氨酸分子深入到疏水的酰基链区域。双层膜研究结果表明,复合物和双层膜的相互作用能够改变双层膜中内外环境的电势差,而电势差的改变会导致双层膜形成亲水性的孔洞。在模拟过程中,结合在亲水性孔洞附近的ε-聚赖氨酸分子能够沿着孔洞向双层膜内环境移动,随后镶嵌在双层膜中或者穿过孔洞进入到双层膜内环境中。单层膜和双层膜的结果共同表明,复合物能够诱导细菌的细菌膜出现孔洞,并能够抑制细菌膜孔洞的自主修复,从而影响细菌的新陈代谢,最终导致细菌死亡。
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