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恶性黑色素瘤是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤之一，近年来受到广泛重视,其临床研究也进展迅速。黑素瘤的恶性程度高、易复发和转移，预后较差，研究显示肿瘤厚度>3mm的患者5年存活率不足60％，发生远处转移后其平均生存期仅为6—9个月，5年生存率<5％。因此全面深入的研究黑色素瘤发生、发展机制，寻找能够有效预测其生物学行为的指标，对其早期诊断、指导治疗和预后具有重要的意义。肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM)是内源性血管活性肽，是日本学者于1993年在嗜铬细胞瘤组织中发现的。Miller M J等观察了肺、肠、乳腺、卵巢、前列腺、脑、软骨、血液等组织来源的人肿瘤细胞系，发现超过90%的肿瘤高表达ADM，并指出ADM在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。ADM是否在黑素瘤也高表达及是否发挥了一定的生物学作用，需要研究证实。第一部分ADM在恶性黑素瘤中的表达目的：检测ADM在人黑素瘤、色素痣组织及黑素瘤细胞系A375中的表达,以探讨ADM在黑素瘤发生、发展中的作用。方法：用免疫组化法检测ADM在人黑素瘤、色素痣组织切片及A375中的表达情况。结果：恶性黑素瘤组织标本中80%检测到ADM的表达，色素痣组织标本中仅有43.3%检测到ADM的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。人的成纤维细胞中ADM为弱阳性、A375中ADM呈强阳性。结论：肾上腺髓质素在人恶性黑素瘤组织及细胞系A375中高表达，在人的色素痣和成纤维细胞中低表达，提示ADM与恶性黑素瘤发生、发展可能密切相关。第二部分AMD在黑素瘤中的作用目的：探讨siRNA沉默肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM）基因后对黑素瘤细胞系A375增殖、凋亡、周期及侵袭力的影响。方法：1.实验分组:采用人黑素瘤细胞株A375，利用人工合成的ADM靶向小分子干扰RNA(small interference RAN,siRNA)转染A375细胞,以抑制ADM的表达，利用人工合成的非特异序列转染A375细胞，作为阴性对照，同时以正常未转染组细胞做为空白对照。2.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫细胞化学法检测处理后各组细胞ADM的表达情况,进而选择最有效siRNA。3.用最有效的siRNA转染A375，分别于24、48h后用MTT法测各组细胞的增殖活性。4.转染48h后，用流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况。5.转染48h后，流式细胞仪检测各组细胞的周期情况。6.转染24h后, Transwell测定沉默ADM对A375体外侵袭力的影响。结果：1.基因干扰后qRT-PCR筛选有效siRNA结果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干扰率分别为：15%，76%,50%。siRNA-2干扰效果最好。2.转染后免细胞化学法筛选有效siRNA结果:空白对照组和转染非特异序列组ADM的染色呈强阳性，阳性细胞数均在90%以上，两者差异无统计学意义(P＞0.05)。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3阳性细胞数分别为80%,35%,90%。siRAN-2组染色强度明显弱于其他组。ADMsiRNA-2干扰效果最好。3.基因干扰后细胞的增殖率：用ADMsiRAN-2转染A37524、48h后各组OD值示：空白对照细胞和阴性对照细胞差别无统计学意义(P＞0.05)，而转染siRNA的细胞与前两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。24、48h的抑制率分别为32.2%、31.5%。4.沉默ADM后A375细胞的凋亡情况：转染48h后用AnnexinV-EGFP/PI染色在流式细胞仪检测，结果显示：转染siADM的细胞早期凋亡率（20.20±6.045）%；空白对照细胞组的早期凋亡率(1.67±0.340)%；阴性对照细胞的早期凋亡率(4.59±1.294)%,转染siADM的细胞与空白对照和阴性对照差异有统计学意义(P <0.05),而空白对照细胞和阴性对照细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。5.沉默ADM后细胞DNA周期分布：转染siRNA细胞的G2/M期细胞比率为(11.360±1.224)%；明显高于空白对照(1.02±0.990)%和阴性对照组(4.150±1.032)%，差异有统计学意义（P<0.05），空白对照与阴性对照差异无统计学意义（P>0.05）。而转染siRNA细胞G1/G0、S期分别是(69.443±2.022)%、(19.197±0.890)%与空白对照(68.567±3.653)%、(30.417±4.588)%和阴性对照(70.530±3.008)%、(23.313±4.465)%，差异均无统计学意义（P>0.05）。6.沉默ADM基因后A375体外侵袭力检测结果：转染siRNA细胞的穿膜数为43.750±3.772，明显少于空白对照的70.500±2.723和阴性对照组的67.500±3.795，差异有统计学意义（P<0.05）；空白对照与阴性对照差异无统计学意义（P>0.05）。MTT法显示转染siRNA细胞的穿膜细胞的OD值为0.185±0.055，低于空白对照的0.363±0.006和阴性对照的0.361±0.086，差异有统计学意义（P<0.05），空白对照与阴性对照差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1沉默ADM基因可抑制A375细胞的生长2沉默ADM基因可促进A375细胞的凋亡3沉默ADM基因主要对A375细胞的G2/M期有影响4沉默ADM基因可降低A375的体外侵袭能力