广东星湖湿地放线菌多样性及其活性研究

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湿地、海洋和森林组成全球三大生态系统,湿地由陆地生态系统向水生生态系统的过渡,能为微生物提供特殊的生存环境条件。据研究,湿地生态系统中蕴藏着丰富的微生物资源,放线菌作为一类重要的类群广泛的存在于多种湿地环境之中。广东星湖湿地是中国第一个国家湿地自然保护区与中国第一批成为世界级的生物圈保护区,是我国亚热带最具典型性和代表性的岩溶湖泊湿地。特殊的地理位置和亚热带季风气候及丰富多样的生态环境不仅造就了星湖湿地特殊的地貌形态也为该区域的微生物提供了特殊的栖息地,定居于此地区的放线菌必然具有鲜明的特点,因此,开展广东省星湖湿地保护区放线菌资源探索及系统分类的研究,对于放线菌资源的开发及可持续发展利用具有重大的理论及现实意义。  本研究首先利用非培养技术分析广东省星湖湿地保护区湖底泥环境中放线菌的物种多样性。应用PCR-DGGE研究星湖湿地10个取样点放线菌群落多样性,并采用DGGE图谱和克隆序列片段测序结果分析星湖湿地保护区物种多样性,再结合取样点物理化学性质对各物种空间分布特征进行分析。利用PCR-DGGE指纹图谱技术了解到不同取样点放线菌物种资源的丰富度(S)、多样性指数(H?)及均匀度指数(J?)均具有不同之处。比较不同取样点的放线菌群落相似性,研究发现这些群落之间的相似性系数具有一定的关联性,相邻的取样点之间相似性程度较高。回收 DGGE明亮条带,并进行克隆、测序,显示出优势菌群主要分布在链霉菌属(Streptomyces)占50.0%、小单孢菌属(Micromonospora)占14.7%、类诺卡氏菌属(Nocardioides)占11.76%。典型对应分析结果表明,显著影响肇庆星湖湿地保护区放线菌菌群群落结构变化的主要因素是湖底泥水溶性碳(WSOC)与速效磷(A-P)。肇庆星湖湿地有数量众多的放线菌菌种资源,物种多样性十分丰富,其具有广阔的利用潜力。  同时采用了常规培养方法对包括上述10个样点在内的26个样品进行了放线菌分离培养。共分离到放线菌340株。去重复筛选出135株代表性菌株,同时利用16S rRNA基因序列的系统发育方法分析了该地区放线菌的种群多样性。主要分布于放线菌纲的7个目、10个科、13个属。这13个属分别为链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、诺卡氏菌属(Nocardia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、微球菌属(Micrococcus)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、红球菌属(Rhodococcus)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、黄色诺尔氏菌属(Knoellia)、微杆菌属(Microbacterium)、野野村放线菌属(Nonomuraea)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora)共13个属。13个属中链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)及诺卡氏菌属(Nocardia)是优势菌属。  挑取83株代表性菌株进行发酵产物抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)活性研究。结果显示具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌株分别有20株(24.09%)和4株(4.8%);而对沙门氏菌没有较好活性。  对分离菌株合成活性次级代谢产物潜力进行评估。选取24株高活性代表菌株进行基于聚酮合酶(PKS I、PKS II)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因、安莎类化合物(AHBA)基因及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGA)基因的活性次级代谢产物潜力PCR检测。结果显示, PKS I阳性率16.7%,PKS II阳性率62.5%,NRPS阳性率16.7%,AHBA阳性率12.5%,HMGA阳性率29.2%。活性复筛及HPLC结果显示,菌株XD007、XD114和XD128显著抑制3株病原指示菌,且能产生大量次级代谢产物。  本论文的研究表明,广东星湖湿地蕴藏着丰富的放线菌资源,抑菌活性试验表明大量放线菌菌株具有较高的的抑菌活性。通过非培养和可培养技术灵活的结合起来,才能有效地提高微生物菌群多样性分析结果的可靠性。活性基因的扩增筛选以及HPLC技术的应用对放线菌的次级代谢产物的分离具有重要的现实及应用意义。
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