胶原蛋白是一种细胞外基质结构蛋白,广泛存在于动物的皮、骨、腱等结缔组织中。胶原蛋白具有特定的氨基酸序列,其生物相容性好,免疫原性低,经常被用作各种生物医学材料,如人造皮肤、药物运送载体、敷料、水凝胶等等。畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白的主要途径,但在胶原蛋白的实际应用时发现,传统牛、猪等动物来源的胶原蛋白可能会传播一些疾病(疯牛病、口蹄疫等),并受到宗教、地域等影响,因此人们不断开发新的胶原蛋白来源。研究报道水母的伞盖组织中含有大量的胶原蛋白,基于水母中胶层干重的胶原得率从13.0%到46.4%不等。水母生物总量大,资源丰富,有可能作为胶原蛋白生物医学应用的重要来源。我们课题组多年来致力于水母来源活性物质及其作用机理的相关研究,故本课题聚焦于水母胶原蛋白分离纯化及其医学应用研究。海水浸泡伤是一种海洋环境下的特殊伤情,由于海水低温、高渗、高致病菌的影响,伤口经海水浸泡后愈合困难。因此,海水浸泡伤发生后,有效的止血、促愈合措施有助于降低海水浸泡伤的恶化风险。市面上常见的一些敷料如纱布、壳聚糖敷料等可在一定程度上起到止血功能,但这些敷料在用于海水浸泡伤的过程中效果欠佳,而海洋来源的水母胶原蛋白敷料有望解决这一难题。本课题中,我们从水母伞盖组织中分离提取胶原蛋白,并制备水母胶原蛋白敷料。建立大鼠海水浸泡伤模型,评价该水母胶原蛋白敷料在海水浸泡伤中的止血、促愈合性能。方法第一部分:水母伞盖胶原蛋白的提取首先,用纯水浸泡腌制的水母伞盖组织,再分别用Na OH去除水母伞盖组织中的杂蛋白,异丙醇去除脂肪,尽量保留胶原蛋白。然后用酸、酶结合的方式进行胶原蛋白的粗提取,并通过改变反应时间、酶量、酸浓度等方式优化提取条件,再使用透析、盐析和超滤等方法得到高纯度水母胶原蛋白。随后,采用天狼星红法、羟脯氨酸检测法、紫外光谱和傅里叶变换红外光谱、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳以及氨基酸组分分析来鉴定纯化后的水母胶原蛋白。最后探究水母胶原蛋白的溶解度、等电点等理化性质。第二部分:水母胶原蛋白敷料的制备及其性质研究首先,采用冷冻干燥法分别制备水母胶原蛋白敷料、交联的水母胶原蛋白敷料和水母胶原蛋白-壳聚糖复合敷料。然后比较3种敷料的吸水性和孔隙率,并进行扫描电镜观察。最后对敷料进行安全性评价,包括使用L929细胞检测敷料的细胞毒性,用稀释的血液检测敷料的溶血活性等。第三部分:水母胶原蛋白敷料的止血和促愈合作用首先,采用体外凝血实验表征敷料的体外凝血指数(BCI),采用血小板粘附实验测定敷料的血小板粘附率。然后建立大鼠海水浸泡伤模型,并分别给与水母胶原蛋白敷料、纱布、壳聚糖敷料等进行干预,在第3、5、7、14 d分别将部分大鼠实行安乐死,伤口部位取材进行免疫组化分析,探究伤口愈合过程中组织学变化,评价敷料的促愈合性能。结果第一部分:水母伞盖胶原蛋白的提取在胶原蛋白的提取中,采用正交实验方法发现酶的使用量起着最关键的作用,然后依次是提取时间、料液比、酸的使用量,最后优化得到的条件是:0.4 mol/L乙酸,0.3%的胃蛋白酶,料液比为1∶2 g/m L,4℃反应72 h。天狼星红法和羟脯氨酸检测表明纯化后的胶原蛋白纯度为97%。SDS-PAGE电泳分析显示水母胶原蛋白杂条带少,分子量在116 k Da以上,符合I型胶原蛋白的特点。水母胶原蛋白的紫外光谱特征吸收峰在220 nm,与标准品牛胶原蛋白特征吸收峰类似。傅里叶变换红外光谱证实在提取过程中,水母胶原蛋白的三螺旋结构得到了较完整的保存。氨基酸组分分析中,水母胶原蛋白的甘氨酸占34.8%,脯氨酸占8.2%,羟脯氨酸为6.3%。符合胶原蛋白三元组件Gly-X-Y一级结构的特点。在水母胶原蛋白的理化性质方面,得到水母胶原蛋白的等电点(p I)约为7。当Na Cl浓度达到0.9 mol/L时,水母胶原蛋白相对溶解度急剧下降。第二部分:水母胶原蛋白敷料的制备及其性质研究对真空冷冻干燥制备好的敷料进行感官评价,显示浓度为3 mg/m L的水母胶原蛋白敷料弹性优良,按压后可恢复形状,白色无杂质、无斑点,对折后不断裂,折痕处无裂痕,表面平整,无大的孔隙。筛选确定的敷料制备条件为:水母胶原蛋白敷料(3 mg/m L),复合敷料(壳聚糖∶胶原蛋白为1∶1),交联剂使用比(EDC∶NHS为4∶1)。扫描电镜观察显示:复合敷料比交联的敷料和水母胶原蛋白敷料的孔隙多。用茚三酮法检测敷料的交联度,证实交联水母胶原蛋白敷料的交联度为28%。可见碳化二亚胺提高了敷料的交联度。敷料理化性质分析结果表明交联敷料的吸水率最高;对于孔隙率,复合敷料的孔隙率最大。最后各组敷料的细胞毒性等级为1级,溶血率均小于5%。表明敷料无明显细胞毒性,溶血性也符合医疗器械相关规定。第三部分:水母胶原蛋白敷料的止血和促愈合作用敷料的血小板粘附能力和体外凝血实验表明,交联的水母胶原蛋白敷料粘附的血小板最多,BCI最小,相比其他敷料,显示出更显著的止血能力。海水浸泡伤大鼠模型疗效观察表明,治疗后3 d和5 d,交联的水母胶原蛋白敷料组和复合敷料组的CD31和TGF-β的阳性表达率很高;7 d和14 d,交联水母胶原蛋白敷料组和复合敷料组的CD31和TGF-β的阳性表达率逐步降低。说明交联的水母胶原蛋白敷料和复合敷料在海水浸泡伤初期就能发挥很好的作用,促使CD31和TGF-β的快速表达,从而缩短海水浸泡伤口的愈合时间,提高海水浸泡伤的愈合能力。结论优化了水母胶原蛋白提取方法,分离得到高纯度水母胶原蛋白,其各项检测指标符合I型胶原蛋白的特征。真空冷冻干燥制备了水母胶原蛋白敷料、交联水母胶原蛋白敷料和水母胶原蛋白-壳聚糖复合敷料等3种类型敷料,表征分析发现交联剂能够提高水母胶原蛋白敷料的交联度,交联敷料的吸水性较强,复合敷料的孔隙率较大。止血效应分析发现交联水母胶原蛋白敷料具有更优的止血能力。安全性评价表明敷料细胞毒性和溶血性均符合医疗器械有关规定。大鼠海水浸泡伤模型疗效观察表明,交联水母胶原蛋白敷料和复合敷料可以缩短海水浸泡伤口的愈合时间,提高海水浸泡伤的愈合能力。