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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus),基因组为单股负链不分节的RNA。NDV能引起对禽类高度致死的疾病新城疫,但对人类而言,NDV并不致病,而是一种重要的溶瘤病毒,研究NDV抗肿瘤的机制有利于NDV在抗肿瘤治疗中的应用。通常认为NDV抗肿瘤的效果源于病毒感染导致的细胞死亡和刺激天然免疫和适应性免疫反应。病毒感染会引起细胞死亡,但其机制并不相同,目前研究发现NDV能诱导细胞凋亡和自噬,凋亡是一种由半胱天冬酶(Caspase)调节的,细胞核和细胞质固缩,细胞膜逐渐形成凋亡小体的细胞死亡方式,不引起炎症,自噬同样不引起炎症,细胞发生自噬会降解细胞组分,在细胞内形成自噬泡,研究发现NDV导致的细胞凋亡在抗肿瘤效应中发挥了重要的作用,而引起的细胞自噬能通过抑制凋亡促进病毒复制,使病毒能大量复制,进而有利于其抗肿瘤,因此我们推测NDV是否引起其他死亡方式发挥抗肿瘤的作用,此外,NDV如何调节宿主天然免疫系统从而成功杀死肿瘤细胞的机制有待研究。天然免疫反应是抵御病原微生物的第一道防线,其中炎症小体是一种大分子的复合信号平台,它能活化前炎性因子pro-IL-1β和pro-IL-18,诱导一种细胞炎性死亡——焦亡(pyroptosis);炎性因子IL-1β和IL-18的分泌需要两个信号,第一信号是pro-IL-1β和pro-IL-18的表达,这由转录激活因子NF-κB信号通路调控,上游主要是模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),例如Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)等,第二信号来源于炎症小体的激活,它能导致Caspase-1自催化激活,活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18,形成有功能的活性形式;焦亡不同于其他细胞死亡方式,由Caspase-1调节,焦亡导致细胞膜破裂并释放大量炎症因子和病原微生物,引起病理性炎症。NDV在发挥抗肿瘤作用中是否会通过炎性小体的途径刺激机体的天然免疫系统,导致肿瘤细胞发生焦亡尚不清楚,围绕“炎症小体——炎症反应”信号通路为主要方向,利用NDV病毒与THP-1诱导的巨噬细胞模型进行了一系列的研究,研究结果表明:(1)NDV感染PMA诱导的THP-1细胞导致IL-1β分泌上调,THP-1细胞经PMA诱导分化形成巨噬细胞,NDV强毒株Herts/33感染12h后,IL-1β分泌显著上调,IL-1β分泌量与病毒感染时间和计量正相关,但UV灭活的病毒不能诱导巨噬细胞分泌IL-1β,通常IL-1β由Caspase-1剪切,Caspase-1的活性由炎症小体调控,采用Caspase-1的抑制剂处理后发现NDV诱导的IL-1β显著下调,表明NDV能诱导IL-1β分泌,且该活性由Caspase-1调控,以上结果表明NDV感染巨噬细胞能够激活炎性小体,诱导IL-1β分泌。(2)NDV激活NLRP3炎症小体,我们通过构建稳定表达shRNA的THP-1细胞系,干扰NLRP3的表达,Western blot结果显示NLRP3干扰细胞系中NLRP3的表达水平下降,已知ATP是NLRP3的阳性刺激物,因此采用LPS+ATP刺激干扰NLRP3的THP-1细胞,结果发现在干扰细胞系中,ATP诱导的IL-1β分泌显著下降,这表明NLRP3干扰成功。NDV感染该细胞系后,IL-1β分泌量同样下降了,同时还构建了NLRP3炎症小体的其他组分的干扰细胞系,ASC和pro-Caspase-1干扰细胞系,结果同样显示NDV诱导的IL-1β水平下调;还通过NLRP3敲除小鼠的骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)验证,以上结果证明NDV可以激活NLRP3炎症小体。(3)NDV感染激活炎症小体,导致细胞发生焦亡;炎症小体活化能诱导一种细胞死亡方式——焦亡,分析NDV对NLRP3干扰细胞系的细胞毒性,细胞接种1MOI的Herts/33后,18h检查细胞死亡情况,相比对照组,干扰细胞系均存活率更高,为了进一步验证该结果,采用了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制剂处理细胞,其中Caspase-1调节焦亡,Caspase-3调节凋亡,Caspase能抑制所有该家族的酶类,结果发现抑制剂能下调细胞死亡率,进一步研究结果发现NDV感染THP-1和HeLa细胞均能诱导GSDMD的剪切,剪切下来的GSDMD的氨基端能直接诱导细胞焦亡,以上结果显示NDV感染可以诱导NLRP3炎症小体活化,并进一步引起细胞焦亡。(4)炎症小体活化能抑制NDV复制,0.01 MOI Herts/33接种THP-1细胞后,不同时间点检查病毒滴度,结果发现在60h时,在NLRP3,ASC和Caspase-1的干扰细胞系中,病毒滴度较高,病毒复制可能得益于细胞未发生焦亡,延长了病毒复制时间,为了进一步验证此结果,我们同样测定了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制剂处理细胞中的病毒滴度,结果一致,这表明NLRP3炎症小体在抵抗NDV感染中发挥重要作用。(5)NDV的P和V蛋白能抑制NLRP3炎症小体活化诱导的IL-1β分泌;我们构建了稳定表达病毒蛋白P、V、W和NP的THP-1细胞系,相比对照组,表达P和V蛋白的细胞在LPS+ATP的刺激下,细胞上清中检查到更少量的IL-1β,为了验证这一结果,选择天然缺失NLRP3和ASC的293T细胞,转染炎症小体组分,重建NLRP3炎症小体,结果发现P和V蛋白同样能抑制IL-1β的分泌,在293T中转染NLRP3和ASC与病毒蛋白,间接免疫荧光结果发现P和V蛋白与NLRP3共定位,以上结果证明NDV的P与V蛋白抑制NLRP3炎症小体活化。本文使用THP-1细胞,证明了NDV能诱导NLRP3炎症小体的活化,并引起细胞炎性死亡焦亡,在细胞水平上验证了NLRP3炎症小体与病毒复制的关系,NLRP3炎症小体是细胞对NDV感染的天然免疫反应,能抑制病毒复制,而病毒蛋白P和V能抑制NLRP3炎症小体的活性,本研究为进一步揭示NDV抗肿瘤机制和应用提供了理论基础。