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选题依据:定坤丹为妇科常用的传统中药复方,相传该方始创于清代乾隆四年,为乾隆帝所赐名。有学者认为定坤丹是由《竹林女科证治》中“补经汤”方加减而成,也有学者认为其是由《妇人大全良方》中的续嗣降生丹加减而成,但其功用类似,现代研究中的临床应用观察也证明了其滋补气血,调经舒郁的功能。定坤丹目前多用于改善常见的痛经、月经不调、多囊卵巢综合征、围绝经期综合征（更年期综合征）、子宫内膜异位症等妇科疾病,还可以用于不孕不育、产后、人流术后的伤口、内膜修复,疼痛的缓解以及术后并发症的预防。定坤丹由红参、鹿茸、西红花、三七、白芍、熟地黄、当归、白术、枸杞子、黄芩、香附、茺蔚子、川芎、鹿角霜、阿胶、延胡索等多种药味组成,药味组成较多为其成分质量研究带来了困难,目前中国药典中收载的质量控制标准的可控性也不强,仅规定了单味药材的显微鉴别（枸杞子、白术、甘草）、药材和成分的薄层鉴别（当归、川芎、枸杞子、白芍、红参、三七对照药材及芍药苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品的薄层鉴别）以及单一成分人参皂苷Rg1的含量测定项目（每丸含量不得少于3.0mg）,这些检测项对定坤丹的质量而言仅限制了其中部分单味药材的质量,不具有整体性特点,故需要对其质量进行深入的研究,以对定坤丹复方进行更好的质量控制。目的:建立适用于定坤丹的指纹图谱检测方法,寻找定坤丹中可作为其质量标志物的稳定存在的活性成分,以提升定坤丹的质量控制标准,为其内在质量控制提供科学依据,保证复方的质量均一稳定。方法:1、采用UPLC-DAD（ultra performance liquid chromatography with diode-array detection）技术对定坤丹甲醇提取物进行了检测,检测时长45min,波长280nm,流动相为0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-甲醇,进行梯度洗脱,构建了适用于定坤丹复方的UPLC分离条件;采用1H-NMR（1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy）技术对定坤丹的两相提取物（甲醇-水相和氯仿相同时提取）分别进行检测,甲醇-水相提取物核磁测定采用noesyppr 1D序列,用氘代甲醇锁场,内标为TSP（trimethylsilylpropionate）,氯仿相提取物采用zg30序列,用氘代氯仿锁场,内标为TMS（tetramethylsilane）,构建其甲醇-水相和氯仿相的核磁指纹图谱;2、采用UPLC-MS（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry）联用技术对定坤丹成分进行表征,通过单味药材溯源,标准品对照,数据库对比,精确分子量拟合等方法结合文献调研对得到的成分质谱数据进行指认,以期明确复方中的成分组成;3、采用网络药理学技术对表征鉴定得到的定坤丹中成分进行分析,对“药材-成分-靶点-疾病”网络进行分析,并进行GO（gene ontology）生物功能及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析以寻找潜在活性成分,起效靶点及作用机制。结果:1、建立了适用于定坤丹的高效简便的UPLC检测方法和1H-NMR指纹图谱检测方法,可相对全面地表征复方的质量。UPLC方法中备样步骤及检测过程均高效简便,其中5-羟甲基糠醛和黄芩苷可作为定坤丹质量标志物的参考;1H-NMR方法中两相提取法的备样过程能够保证全面表征复方中低极性和极性较大的成分。2、通过UPLC-MS技术得到的色谱及质谱数据,结合标准品对照、文献查询、数据库比对等方法,鉴定了121个成分,包括氨基酸类、酚酸类、内酯类、萜类、生物碱类、皂苷类、黄酮类化合物及其它化合物。其中芍药苷,三七皂苷R1,人参皂苷Rg1,人参皂苷Rb1可作为定坤丹质量标志物的参考。3、通过网络药理学分析,发现定坤丹中的77个潜在活性成分和与临床适用症相关的87个潜在作用靶点,其中定坤丹中的12种人参皂苷、4种三七皂苷、西红花苷I、松果菊苷、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷等成分可能是复方发挥疗效的潜在活性成分。定坤丹可能是通过参与雌激素和孕激素调节通路,以及子宫胚胎发育,平滑肌调节,造血及凝血过程和常规的免疫和炎症反应来发挥临床作用的。4、上述方法中得到的潜在活性成分中,黄芩苷、芍药苷、西红花苷I、毛蕊花糖苷、人参皂苷和三七皂苷类成分可作为定坤丹质量标准建立的备选参考。结论:1、建立的UPLC和1H-NMR指纹图谱备样及检测方法相对全面地表征了定坤丹中初级和次级代谢产物,可作为定坤丹指纹图谱标准提升的参考依据。2、通过UPLC-MS鉴定了121个化学成分及异构体,其中黄芩苷、芍药苷、人参皂苷、三七皂苷、西红花苷I、毛蕊花糖苷可作为定坤丹含量测定标准的备选成分。3、网络药理学分析探索发现定坤丹可能是通过参与雌激素和孕激素调节通路,以及子宫胚胎发育,平滑肌调节,造血及凝血过程和常规的免疫和炎症反应来发挥临床作用的,可为进一步明确其作用机制提供研究思路。