研究背景热射病(heat stroke,HS)以高温(核心体温超过40℃)、神经功能障碍为主要表现,按发病原因可分为经典型热射病(classical heat stroke,CHS)与劳力性热射病(exertional heat stroke,EHS),这两者最终均可导致多器官功能衰竭。有文献表明热射病患者的死亡率正在逐年上升,约有30%的幸存者遗留有永久性的神经系统与肢体功能障碍。目前,对热射病仍缺乏特定及有效的治疗方法。热射病是一种全身性疾病,其最终导致的多器官功能衰竭是一个复杂的病理生理过程。近年来研究认为是高温引发了一系列的全身反应,包括全身炎症反应与凝血功能紊乱,且这两者相互影响。由此可知,在HS的发生发展过程中,全身炎症反应扮演着重要的角色。此中,内皮细胞损伤与凝血功能紊乱也是HS发生发展的重要环节。在热射病中,全身炎症反应的形成有多方面的因素。有学说认为：HS发生过程中,肠粘膜对内毒素的通透性增大,肠道内毒素大量进入血液循环,刺激免疫细胞,释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6等细胞因子,这些细胞因子与内毒素共同作用,引发炎性级联反应,最终导致热射病及其并发症的发生。血管内皮覆盖在各级动脉、静脉及毛细血管的管腔内面,被认为是血流与外血管壁的选择性渗透屏障。内皮通过多方面的作用来维持血管的稳态,包括维持血管张力,平衡血流动力学,抑制血栓的形成,控制血管炎症反应进程。上述重要生理功能均与血管内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)合成和释放一氧化氮(NO)有关。NO是一种重要的内皮源性释放因子,在维持血管张力和血管活性中作用重大,其可以抑制炎症、氧化应激、细胞凋亡,从而保护内皮；可以抑制血小板和白细胞活化,抑制凝血,从而改善凝血异常[43-45]。NO由eNOS催化L-精氨酸合成。当切应力及化学物质如乙酰胆碱、缓激肽、血管内皮生长因子等刺激血管内皮时,内皮细胞可通过蛋白激酶A(PKA)、3-磷酸磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-PKB即PI3K-Akt)、腺嘌呤核糖核苷酸依赖激酶(AMPK)信号转导途径激活eNOS,合成和释放NO。NO再通过自由扩散或血红蛋白α(Hbα)依赖方式运输到内皮下血管平滑肌,激活平滑肌细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)等信号转导途径,引起平滑肌舒张,从而扩张血管,称内皮依赖性舒张功能。测定动物和人体内皮依赖性血管舒张功能可反映内皮功能,从而可以评估内皮的损伤程度。在热射病的病理生理过程中,一系列炎症反应、大量氧自由基蓄积、血流动力学改变等共同引起内皮细胞的损伤,导致其结构与功能的改变,造成一系列的病理变化。在热应激急性反应期,内皮细胞出现显著的凋亡,而内皮细胞凋亡导致细胞膜上抗凝成分部分丢失,质膜中蛋白S部分暴露,凝血抑制剂表达减少,从而激活促凝通路,导致凝血功能紊乱,出现弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC),进而推动多器官功能衰竭的发展。丹参酮IIA是传统中药丹参的提取物,丹参酮IIA磺酸钠(sodium tanshinone ILA sulfonate,STS)是由丹参酮IIA磺化而来的水溶性物质。丹参酮IIA水溶性差,而丹参酮IIA磺酸钠因改变丹参酮IIA的生物药效,水溶性强而被广泛用于冠心病的治疗。然STS的药理作用远不止于此,现STS已被证明有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抑制心肌细胞的肥大、对心脏内皮细胞的保护等。全身炎症反应、内皮细胞损伤、凝血功能紊乱参与了HS的发生发展,三者相互影响,最终导致多器官功能衰竭。据STS的药理作用推测,其可影响HS发生发展的多个环节。因此我们认为,STS的多重药理作用使其可能减轻热射病病理过程中炎症反应的发生、凝血功能的异常,进而减轻多器官功能的损害。研究目的本研究旨在明确：1.STS干预能否减轻热射病大鼠炎症反应；2.STS干预能否改善热射病大鼠内皮细胞损伤;3.STS干预能否改善热射病大鼠DIC；4.STS干预能否减轻热射病大鼠多器官损伤。方法1、动物及模型建立雄性SPF级SD大鼠72只,体重200～260 g,购于湖北省实验动物研究中心。动物置于(25±1)℃,相对湿度为(50±10)%,白天黑夜各12 h的SPF级环境中适应性喂养1周,自由进食、饮水。实验开始,所有实验动物腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg予以麻醉,当动物的角膜反射与疼痛反射消失,呼吸、心率平稳时,视为麻醉成功。麻醉成功后将欲热暴露的动物置于动物体温维持仪的电热毯上,预设温度为35℃,每5 min监测1次核心体温(直肠温度),直至建模成功。当核心体温达到43.5℃时,视为热射病建模成功。2、实验分组实验分为以下几组：①正常对照(NC)组(n=8),将麻醉后的大鼠置于26℃的环境中,不做其它处理,直至实验结束。②热射病(HS)组(n=32),该组又分为以下几个亚组：(1)大鼠热射病建模成功后,转移到26℃的环境中,恢复0小时(HS0)；(2)大鼠热射病建模成功后,转移到26℃的环境中,恢复2小时(HS2)；(3)大鼠热射病建模成功后,转移到26℃的环境中,恢复6小时(HS6)；(4)大鼠热射病建模成功后,转移到26℃的环境中,恢复12小时(HS12)。③STS(5-40mg/kg)治疗组(n=32),该组又分为以下几个亚组：(1)大鼠热射病建模成功后,立即股静脉注射STS(5mg/kg),然后转移到26℃的环境中恢复6小时(STS-6-5)；(2)大鼠热射病建模成功后,立即股静脉注射STS(10mg/kg),然后转移到26℃的环境中恢复6小时(STS-6-10)；(3)大鼠热射病建模成功后,立即股静脉注射STS(20mg/kg),然后转移到26℃的环境中恢复6小时(STS-6-20)；(4)大鼠热射病建模成功后,立即股静脉注射STS(40mg/kg),然后转移到26℃的环境中恢复6小时(STS-6-40)。3、标本的采集及检测所有大鼠完成预设处理后腹主动脉采血及器官标本的采集。血清TNF-α、IL-6、IL-1p水平按ELISA试剂盒说明进行检测。大鼠采血后,立即分离主动脉,取部分胸主动脉行内皮依赖性舒张功能测定,剩余的用4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,再进行TUNEL与CD31荧光双染,在荧光显微镜下观察内皮细胞凋亡情况并统计凋亡比率。血浆PT、APTT、D-二聚体的水平用全自动凝血分析仪进行检测,血小板计数用自动血液检测仪检测,血清Cr、BUN、ALT、AST、ALP、LDH用全自动生化分析仪检测。肝、脾、肺、肾、肾上腺、小肠组织取出后,用4%多聚甲醛固定,用石蜡包埋并制成4um的切片,随后进行HE染色,然后在光镜下观察其病理变化。4、统计学方法实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,各组间的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),多样本均数间多重比较用LSD-t检验(方差齐)或用Dunnett’s T3检验(方差不齐)。以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。结果1、各组大鼠炎症因子变化的比较HS各组血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平显著高于NC组(均P<0.05),而HS6组上述炎症因子水平高于其它HS亚组(P<0.05)。STS各治疗组上述炎症因子水平均显著低于HS6组(均P<0.05),而STS-6-40组炎症因子水平为各治疗组中最低(P<0.05)。2、各组大鼠主动脉内皮细胞凋亡的比较HS各组主动脉内皮细胞的凋亡显著高于NC组(均P<0.05),而HS6组主动脉内皮细胞凋亡高于其它HS亚组(P<0.05)。STS各治疗组主动脉内皮细胞凋亡显著低于HS6组(均P<0.05),而STS-6-40组主动脉内皮细胞凋亡为各治疗组中最低(P<0.05)。3、各组大鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能的比较。HS6组主动脉血管内皮舒张功能较NC组显著下降。而STS-6-40组主动脉血管内皮舒张功能较HS6组好转。(P<0.01)4、各组大鼠DIC情况的比较HS6组PT、APTT、D-二聚体水平显著高于NC组上述指标的水平(P<0.01),HS6组血小板计数值显著低于NC组(P<0.01)。而STS-6-40组PT、APTT、D-二聚体水平均较HS6组明显降低(均P<0.01)；STS-6-40组血小板计数的值显著高于HS6组(P<0.01)各组HE染色所见病理变化如下所述：NC组主要器官未见明显异常。HS6组主要器官中可见弥散性血管内凝血。血管内血栓见于小、中型血管,而且在肺、肾、肾上腺、肝组织细胞间隙内可见出血。然而,在STS-6-40组中血栓及出血较HS6组有明显改善。5、各组大鼠器官损伤指标的比较HS6组血清Cr、BUN、ALT、AST、ALP、LDH水平显著高于NC组,两组差异均有统计学意义(P<0.01)。而STS-6-40组上述器官损伤指标的水平比HS6组明显降低(均P<0.01)。6、各组大鼠器官病理变化的比较各组HE染色所见病理变化如下所述：NC组主要器官未见明显异常。HS6组主要脏器病理损伤显著。肝小叶结构紊乱,肝细胞变性,肝血窦内充血,门管区可见大量炎性细胞浸润,中央静脉内可见大量红细胞瘀滞、血栓形成。脾组织结构紊乱,红髓与白髓界限不清,动脉周围淋巴鞘结构不清楚,边缘区可见淤血。肺泡明显扩张,大多数肺泡结构崩解,肺泡管内表面可见透明膜形成。肺间质明显增厚,可见大量炎性细胞浸润,并可见散在点状出血；中、小、微血管内可见血栓形成。肾小管上皮肿胀,管腔内可见管型形成,间质可见大量出血并炎性细胞浸润。小肠壁水肿、增厚,绒毛结构紊乱,局部大量炎性细胞浸润。STS-6-40组主要脏器病理损伤较HS6组明显减轻。结论1.STS干预能减轻热射病大鼠炎症反应；2.STS干预能改善热射病大鼠内皮细胞损伤；3.STS干预能改善热射病大鼠DIC；4.STS干预能减轻热射病大鼠多器官损伤。