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第一部分Klotho对糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用及机制的研究目的:探讨Klotho对糖尿病小鼠的心肌保护作用及机制方法:40只6周龄C57BL/6小鼠(重约18-22g)购自南昌大学动物实验中心,适应性喂养一周后,采用链脲霉素(Streptozotocin,STZ)(130 mg/kg)一次性腹腔注射构建糖尿病模型,1个星期后于小鼠尾静脉采血,检测随机血糖>16.8 mmol/L者纳入糖尿病模型;小鼠随机分为以下3组:(1)对照组(Con);(2)模型组(DM);(3)Klotho处理组(DM+KL);给予DM+KL组小鼠腹腔注射Klotho(0.01 mg/kg/48h),DM组小鼠腹腔注射等剂量PBS配制液,期间定期监测小鼠血糖、体重变化;药物给予12周后,进行如下实验:(1):测量小鼠体重、心重、胫骨长度,检测小鼠空腹血糖;(2)收集各组小鼠心脏彩超的LVEF、LVFS、E’/A’变化并比较分析;(3):眼眶静脉丛采血,ELISA检测各组小鼠血清TNF-ɑ、IL-18、IL-1β变化;(4):检测各组小鼠血清LDH、CK-MB含量;(5):HE染色比较各组小鼠心肌结构变化;(6):Masson染色检测各组小鼠心肌纤维化程度并比较各组胶原容积分数;(7):TUNEL染色比较各组大鼠心肌细胞凋亡情况;(8):免疫组化检测各组大鼠心肌NLRP3、IL-18表达水平,;(9):RT-qPCR比较各组心肌组织ANP、BNP、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、ASC基因水平变化(10):Western blot测定各组心肌组织collagen I、collagen III、α-SMA、cleaved-caspase-3、TXNIP、NLRP3、mIL-1β、cleaved-caspase-1、ASC蛋白表达相对变化并比较分析。结果:1.相较于对照组,DM组小鼠在STZ注射后1周,血糖明显上升,体重逐渐下降,Klotho对小鼠血糖、体重无明显改变;2.相较于对照组,DM组小鼠的心重/体重、心重/胫骨长度比值增高,Klotho干预后心重/体重、心重/胫骨长度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);3.与对照组相比,DM组小鼠ANP、BNP mRNA表达上升,Klotho干预后ANP、BNP mRNA表达下降(p<0.05);4.相较于对照组,DM组血清LDH、CK-MB量增多,与DM组相比,Klotho组血清LDH、CK-MB减少;5.心脏彩超结果显示:DM组相较于对照组射血分数、短轴缩短率、E’/A’比值下降;Klotho干预后射血分数、短轴缩短率、E’/A’比值升高;6.HE染色结果:相较于对照组,DM组心肌纤维排列紊乱,大量炎细胞浸润,Klotho处理后明显改善;Masson染色结果显示:Klotho处理后胶原纤维沉积减少,胶原容积分数较DM组明显下降(P<0.05);免疫组化结果显示:DM组心肌组织出现明显棕黄色区域,Klotho处理后明显改善;TUNEL染色结果显示:相较于DM组,Klotho组心肌细胞凋亡细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);7.ELISA结果显示:DM组相较于对照组血清IL-18、IL-1β、TNF-ɑ升高,Klotho组小鼠IL-18、IL-1β、TNF-ɑ水平下降8.心肌组织RT-qPCR结果显示:相较于对照组,DM组TXNIP、NLRP3、Caspase-1、ASC水平上升,Klotho处理后TXNIP、NLRP3、Caspase-1、ASC基因水平明显下降。9.Western blot结果显示:相较于对照组,DM组collagen I、collagen III、α-SMA、cleaved-caspase-3、TXNIP、NLRP3、mIL-1β、cleaved-caspase-1、ASC表达增加,Klotho处理后collagen I、collagen III、α-SMA、cleaved-caspase-3、TXNIP、NLRP3、mIL-1β、cleaved-caspase-1、ASC表达水平明显下降。结论:1、Klotho改善了糖尿病小鼠的心肌肥厚、减少了心肌组织病理损伤以及抑制了心肌细胞炎症反应;2、Klotho对糖尿病小鼠的保护机制可能与其抑制了NLRP3炎症体的活化有关;第二部分Klotho对高糖诱导的心肌细胞损伤的保护作用及机制目的:1.探究Klotho对高糖诱导的炎症小体活化的影响和机制2.探究Klotho调控NLRP3炎症体的机制3.探究Klotho对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响及机制方法:1.Klotho对高糖诱导下炎症小体的影响,实验分组:(1)正常糖组(Con,H9C2细胞培养基中葡萄糖浓度为5.5mM);(2)高糖组(HG,H9C2细胞培养基中加入35mM葡萄糖培养48h);(3)高糖+Klotho组(HG+KL,H9C2细胞培养基中加入400pM Klotho预培养1h,然后加入35mM葡萄糖共培养48h);RT-qPCR检测各组NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1基因表达情况;Western blot观察各组NLRP3、ASC、mIL-1β、P20蛋白表达相对变化。ELISA检测各组IL-1β、IL-18、TNF-ɑ炎症因子变化;2.探究Klotho调控NLRP3炎症体的机制,实验分组:(1)正常糖组(Con,H9C2细胞培养基中葡萄糖浓度为5.5mM);(2)高糖组(HG,H9C2细胞培养基中加入35mM葡萄糖培养48h);(3)高糖+Klotho组(HG+KL,H9C2细胞培养基中加入400pM Klotho预培养1h,然后加入35mM葡萄糖共培养48h);(4)高糖+N-acetyl-L-cysteine组(HG+NAC,H9C2细胞培养基中加入5mM N-acetyl-L-cysteine预培养1h,然后加入35mM葡萄糖共培养48h);DCFH-DA法检测细胞内活性氧变化;Western blot检测TXNIP蛋白表达变化;ELISA检测各组IL-1β炎症因子变化;3.探究Klotho对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响及机制,首先用NLRP3siRNA转染H9C2细胞,Western blot验证转染效率,成功后将细胞分为:(1)正常糖组(Con,H9C2细胞培养基中葡萄糖浓度为5.5mM);(2)高糖组(HG,H9C2细胞培养基中加入35mM葡萄糖培养48h);(3)高糖+NLRP3 siRNA组(HG+siNLRP3,NLRP3 siRNA转染细胞,24h后加入35mM葡萄糖,培养48h);(4)高糖+Klotho组(HG+KL,H9C2细胞培养基中加入400pM Klotho预培养1h,然后加入35mM葡萄糖共培养48h);AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率;Western blot观察各组凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、细胞色素c(Cyto c)表达相对变化;JC-1法观察细胞线粒体膜电位变化。结果:1.Klotho抑制高糖诱导的H9C2细胞NLRP3炎症体的活化RT-qPCR结果显示:相较于对照组,高糖组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC基因表达明显上升,Klotho干预后NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC基因表达降低;Western blot结果显示:高糖组NLRP3、ASC、mIL-1β、P20蛋白表达增加,Klotho干预后NLRP3、ASC、mIL-1β、P20蛋白表达下降;ELISA结果显示,高糖诱导H9C2细胞IL-1β、IL-18、TNF-ɑ释放增加,Klotho干预能明显减少细胞IL-1β、IL-18、TNF-ɑ的释放。2.Klotho通过抑制ROS/TXNIP减少NLRP3炎症体的活化活性氧检测结果显示:相较正常糖组,高糖组心肌细胞活性氧释放增加,相较高糖组,活性氧抑制剂NAC和Klotho预培养明显减少了高糖诱导的活性氧释放。Western blot结果显示:相较正常糖组,高糖组H9C2细胞TXNIP蛋白表达明显增加,NAC和Klotho预培养能明显减少高糖诱导的TXNIP蛋白表达。ELISA结果进一步表明,NAC和Klotho预培养明显减少了高糖诱导的IL-1β炎症因子释放。3.Klotho通过抑制高糖诱导的NLRP3炎症体活化,减少心肌细胞损伤首先Western blot结果显示:NLRP3 siRNA组NLRP3、mIL-1β、p20蛋白表达明显减少,提示转染成功;细胞转染后流式实验显示:相较正常糖组,高糖组细胞凋亡率明显上升,Klotho或siNLRP3干预后,细胞凋亡率明显下降,Klotho组与siNLRP3组细胞凋亡率无明显差异(p>0.05);Western blot结果显示:相较正常糖组,高糖组凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、Cyto c蛋白表达增加,Klotho或siNLRP3干预后凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、胞质Cyto c蛋白表达明显下降;Klotho组与siNLRP3组细胞蛋白表达无明显差异(p>0.05);线粒体膜电位荧光染色提示:相较正常糖组,高糖组线粒体膜电位明显下降,Klotho或siNLRP3干预明显阻止了线粒体膜电位的下降。结论:1.Klotho抑制高糖诱导的NLRP3炎症小体的活化;2.Klotho通过ROS/TXNIP途径调控NLRP3炎症体;3.Klotho和siNLRP3干扰通过抑制Cyto c/caspase-3减少了高糖诱导的心肌细胞凋亡。