1.研究目的探讨青黄散加补肾健脾中药治疗骨髓增生异常综合征(MyelodysplasticSyndromes,MDS)患者体内砷的吸收、分布及代谢情况,为了解青黄散药代动力学及作用机制提供依据。2.研究内容2.1青黄散加补肾健脾中药治疗骨髓增生异常综合征患者体内砷形态分析运用原子荧光光谱联合高效液相色谱法(AFS-HPLC)对15例经过青黄散加补脾肾中药治疗的MDS患者尿液及血浆中三价无机砷(AsⅢ)、五价无机砷(AsV)、一甲基砷酸(MMA)及二甲基砷酸(DMA)四种砷形态进行检测分析,并比较不同疗效的患者体内砷浓度差异。研究使用青黄散后砷在机体内的代谢产物,探讨其在MDS患者体内的代谢特性。2.2青黄散加补肾健脾中药治疗骨髓增生异常综合征患者骨髓及外周血砷的吸收分布研究通过微波消解-原子荧光光谱法(HG-AFS)对20例MDS患者口服青黄散加补肾健脾中药后骨髓和外周血中砷含量进行测定,分析砷在骨髓与外周血全血及血浆的分布差异,有核细胞与成熟红细胞中的分布差异,探讨青黄散在MDS患者血液系统中的药物吸收分布特性及药物作用靶器官。2.3青黄散与其他含砷制剂在人工胃肠液中的溶出情况比较通过运用微波消解-原子荧光光谱法(HG-AFS)比较三种含砷制剂As2S2(Sigma试剂)、雄黄、青黄散在模拟人体胃肠道环境中的溶出情况,以探讨中药雄黄较化学品As2S2及含砷中药复方在胃肠液中溶解差异性,探讨与其他含砷制剂相比,含砷复方中药制剂青黄散在人体胃肠道内吸收的特性及影响因素。3.研究方法3.1临床病例观察根据研究内容搜集符合入组标准的MDS患者,记录病历资料并进行疗效评价;采集生物样本(血液、骨髓、尿液)进行检测,并运用统计学方法比较检测结果。3.2微波消解法(HG)微波消解是指在封闭空间中运用强酸/强碱在微波加热、高温高压的环境下快速溶解样本的一种方法,本研究使用含砷样本0.5ml,加入1ml硝酸、磁性转子置入消解仪中进行砷的溶解。3.3原子荧光光谱法(AFS)原子荧光光谱法即在氢化物的作用下,对原子态的砷荧光谱线的波长和强度进行定量分析的方法。在使用时,需根据原液配置好标准曲线、载液及还原剂。本研究中将微波消解后的含砷制剂定容后可进行AFS检测。3.4高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法即以流动相为载体,采用高压输液系统,将具有不同极性砷剂泵入装有固定相的色谱柱内,在柱内各成分被分离并形成不同的曲线。在使用时需根据检测的砷形态种类配置标准曲线、流动相。3.5模拟胃肠环境的体外试验方法通过配置好的人工胃肠液,经过4小时、37℃恒温振荡箱振荡,模拟出正常情况下人体胃肠道PH值、温度及蠕动特性,对不同砷剂的溶出情况进行检测对比。4.研究结果4.1青黄散加补肾健脾中药治疗骨髓增生异常综合征患者体内砷形态分析4.1.1尿中四种砷形态比较15例患者的尿中均可检测到AsⅢ、DMA、MMA、AsV四种砷形态。其中AsⅢ浓度为 288.88± 181.9μg/L,DMA 浓度为 996.41±615.33μg/L,MMA 浓度为325.16±209.74μg/L,而AsV浓度为9.34±8.21μg/L。尿中四种砷形态浓度从高到低依次为:DMA>MMA>AsⅢ>As V。尿中DMA砷浓度明显高于AsⅢ及MMA砷浓度(P=0.001,P=0.001);而MMA与AsⅢ之间浓度无显著差异(P=0.645);AsⅢ浓度明显高于AsV砷浓度(P=0.001)。4.1.2不同青黄散给药剂量患者尿砷形态比较15例患者中,高剂量组(青黄散0.3g/粒,单日一粒,双日两粒)患者尿中AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度分别为 349.37±256.85μg/L、1482.11±345.13μg/L、540.04±160.5μg/L、9.07±4.27μg/L;正常剂量组(青黄散0.3g/粒.日一粒)患者尿中 AsⅢ、DMA、MMA、AsV 砷浓度分别为 296.24±158.4μg/L、937±605.66μg/L、291.33±184.11μg/L、10.23±9.41μg/L。高剂量组四种砷浓度稍高于正常剂量组,但两组患者尿中不同形态砷浓度均无显著差异(P=0.697、P=0.052、P=0.073、P=0.93 8)4.1.3患者血浆与尿中四种砷形态浓度比较15例患者中9例患者同时进行了血浆和尿中砷形态的检测。其中尿中AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度分别为 285.4±142.01μg/L、991.39±751.47μg/L、310.06±219.24μg/L、14.04±9.21μg/L;血浆中 AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度分别为 2.8±2.12μg/L、7.29±4.68μg/L、2.67±2.24μg/L、0.38±0.42μg/L。血浆中 DMA浓度明显高于AsⅢ(P=0.026);AsⅢ与MMA浓度无明显差异(P=0.971);AsⅢ浓度明显高于AsV(P=0.001)。血浆与尿中砷形态的浓度分布一致,即浓度由高到低依次为:DMA>AsⅢ(MMA)>AsV,见图7。4.1.4不同疗效的患者尿中砷浓度比较血液学进步组患者尿中AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度分别为411.12±163.411μg/L、972.32±730.35μg/L、335.16±244.2μg/L、12.49±10.61μg/L;无血液学进步组患者尿中 AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度分别158.38±107.52μg/L、894.88±535.66μg/L、238.74±167.15μg/L、7.52±4.39μμg/L。无血液学进步组患者尿AsⅢ浓度明显高于血液学进步组患者(P=0.003)。4.1.5不同疗效的患者血浆砷浓度比较血液学进步组患者血浆中AsⅢ、DMA、MMA、AsV砷浓度与无血液学进步组患者血浆中四种砷浓度比较无显著差异(P=0.886、P=0.443、P=0.6、P=0.773)。4.1.6不同疗效患者尿与血浆中DMA/AsⅢ比较血液学进步组患者尿中DMA/AsⅢ平均倍数为6.34±1.66;无血液学进步组患者尿中DMA/AsⅢ平均倍数为2.72±3.77。两组差异显著(P=0.004);在血浆中,血液学进步组患者DMA/AsⅢ平均倍数为3.46±0.44;无血液学进步组患者DMA/AsⅢ平均倍数为2.54±1.97。两组无显著差异(P=0.286)。4.2青黄散加补肾健脾中药治疗骨髓增生异常综合征患者骨髓及外周血砷的吸收分布研究4.2.1骨髓与外周血总砷浓度比较MDS患者经6个月青黄散治疗后,骨髓(BM)中的总砷浓度为47.23±21.67μg/L,外周血(PB)总砷浓度为41.27±14.48μg/L。二者比较差异无统计学意义(P=0.51)。4.2.2骨髓与外周血血浆砷浓度比较MDS患者中骨髓(BM)与外周血(PB)血浆均检测出者为13人。其中的骨髓中血浆浓度为18.22±12.97μg/L,外周血血浆浓度为17.35±11.31μg/L。二者比较差异无统计学意义(P=0.95)。4.2.3外周血中血浆砷浓度占总砷浓度比例患者外周血血浆(PA)中位砷浓度为14.19(10.2,19.1)μg/L;15例患者外周血全血中位砷浓度为39.52(34.18,48.4)μg/L;患者血浆砷浓度占全血砷浓度中位百分数为41.3%(21.68%,61.64%)。4.2.4骨髓有核细胞与成熟红细胞砷含量的比值15例患者骨髓有核细胞(ANC)砷含量显著高于成熟红细胞(RBC)砷含量(P=0.001);患者骨髓有核细胞与RBC砷含量中位倍数为113.64(52.86,169)。4.3青黄散与其他含砷制剂在人工胃肠液中的溶出情况比较4.3.1不同砷剂在人工胃液中的溶出量比较As2S2、雄黄、青黄散在人工胃液中溶出浓度分别为3.93±1.54μg/L、29.28±1.77μg/L、51.3±6.23μg/L,砷浓度由高至低依次为:青黄散>雄黄>As2S2,三者相比差异差异显著(P=0.027)。4.3.2不同时间对青黄散在人工胃液中溶出情况影响青黄散在人工胃液中第1、2、3、4小时溶出量分别为31.24±8.64μg/L、42.78±0.47μg/L、44.95±5.59μμg/L、51.3±6.23μg/L,随时间延长,青黄散的溶出量有所增加,但不同时间比较,砷浓度无显著统计学差异(P=0.392)。4.3.3不同砷剂在人工肠液中的溶出情况比较As2S2、雄黄、青黄散在人工肠液中平均溶出浓度分别为1.72±0.38μg/L、21.64±3.22μμg/L、38.6±3.61μg/L,砷浓度由高至低依次为:青黄散>雄黄>As2S2,三者相比差异显著(P=0.031)。4.3.4肠道细菌对青黄散在人工肠液中溶出情况的影响青黄散在人工肠液与加入三联活菌的人工肠液中溶出量分别为38.6±3.61μg/L、24.93±2.52μg/L,合并了三联活菌的人工肠液使青黄散的溶出量更低,两者差异显著(P=0.049)4.3.5不同砷剂在人工胃肠液中溶出情况比较As2S2、雄黄、青黄散在人工胃液溶出量分别为3.93±1.54μg/L、29.28±1.77μg/L、51.3±6.23μg/L;三者在人工肠液中的溶出量分别为1.72±0.38μg/L、21.64±3.22μg/L、38.6±3.6]μg/L。相较于人工肠液,三种含砷制剂在人工胃液中的溶出量更高。雄黄在人工胃液中的溶出量显著高于人工肠液(P=0.033);而As2S2在人工胃肠液中的溶出度无显著差异(P=0.094);青黄散在人工胃肠液中的溶出量无显著差异(P=0.067)。5.结论5.1 MDS患者服用青黄散加补脾肾中药后,AsⅢ、AsV、MMA、DMA在尿及血浆中均可检测到,并呈现一定规律性。患者血浆与尿液中均表现为DMA含量最高,AsV含量最低,AsⅢ与MMA含量相当。与获得血液学进步组患者比较,疗效不佳的患者尿液中AsⅢ含量相对更多,DMA相对更少,DMA/AsⅢ值明显更低。5.2服用青黄散加补脾肾中药后砷在骨髓与外周血中的分布基本平衡,二者总砷浓度、血浆砷浓度均相近。患者血浆中可检测到砷,但血浆并非砷的主要分布场所。相对于成熟红细胞,砷剂对有核细胞具有更高的亲和力。5.3 As2S2、雄黄和青黄散三种砷剂进入消化道内可有少部分迅速溶解,不同砷剂在胃肠道中的溶解程度不同,青黛配伍雄黄的溶解度高于单用雄黄者,而As2S2的溶解度则显著低于同剂量的雄黄。