【摘 要】
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以稀土作为诱导子,建立了Ce诱导东北红豆杉细胞悬浮培养体系,尝试应用细胞信号转导理论研究Ce诱导红豆杉细胞凋亡与紫杉醇合成的机制.系统考察了不同浓度和化学价态的Ce对悬浮培养东北红豆杉细胞代谢的影响.分别从形态学和生物化学角度证明1mMCe能诱导细胞凋亡.采用二维凝胶电泳技术,分析了Ce诱导凋亡细胞的蛋白表达差异.应用X-射线微区分析技术确定了Ce分布于细胞壁、细胞膜及二者之间.提出Ce通过激活细
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以稀土作为诱导子,建立了Ce<4+>诱导东北红豆杉细胞悬浮培养体系,尝试应用细胞信号转导理论研究Ce<4+>诱导红豆杉细胞凋亡与紫杉醇合成的机制.系统考察了不同浓度和化学价态的Ce对悬浮培养东北红豆杉细胞代谢的影响.分别从形态学和生物化学角度证明1mMCe<4+>能诱导细胞凋亡.采用二维凝胶电泳技术,分析了Ce<4+>诱导凋亡细胞的蛋白表达差异.应用X-射线微区分析技术确定了Ce分布于细胞壁、细胞膜及二者之间.提出Ce<4+>通过激活细胞膜上受体,调控细胞信号转导而诱导细胞防御响应的假设.通过动态检测胞外pH和Ca<2+>浓度,结合药理学抑制剂方法,在考察了1mMCe<4+>对细胞离子流的激活作用的基础上,探讨了离子流在Ce<4+>诱导调控中的作用.系统分析了1mMCe<4+>对氧迸发的诱导作用及其机理,并应用抑制剂方法分析了氧迸发在Ce<4+>诱导调控中的作用.药理学抑制剂实验表明G-蛋白、磷酸酶和phospholipase C(PLC)参与了Ce<4+>对紫杉醇合成和细胞凋亡的诱导调控.时序研究确定了各信号分子的启动时域:磷酸酶—0~30min,Ca<2+>通道和PLC—45~60min,H<+>内流可能位于信号转导路径的最前沿,NADPH氧化酶的激活处于上述信号事件的下游.建立了初步的Ce<4+>诱导紫杉醇合成和细胞凋亡的信号转导生物学模型.Ce<4+>至少通过两种方式共同激活了紫杉醇合成和细胞凋亡:①Ce<4+>引起培养环境pH迅速降低,产生的质子动力促进H<+>和Ca<2+>的跨膜内流;②Ce<4+>直接或间接激活膜受体;随后异三聚体G-蛋白、离子通道、PLC相继被激活;从而引起蛋白激酶的活化和胞内Ca<2+>激增(包括①中引起的胞内Ca<2+>激增),两者共同激活膜上NADPH氧化酶,产生的O<,2>诱导防御基因的激活,最终诱导的紫杉醇合成和细胞凋亡的发生.其中受体的激活需要蛋白磷酸酶的参与.Ce<4+>诱导的紫杉醇合成和细胞凋亡可能是同一信号通路上的并列事件,或是同一信号通路上具有时序和因果关系的两个上下游事件.
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