DNA损伤应答是细胞维持正常生命活动的重要措施,是保持基因组稳定性的关键机制。由于来自细胞外或细胞内部的因素,人体细胞每天会产生大量的形式多样的DNA损伤,这些损伤被及时并正确的修复可以防止发生基因组畸变。没有修复的DNA损伤会导致基因组突变,基因组突变是癌症发生、发展的重要原因。所以,DNA损伤应答通路的研究一直是生命科学研究的前沿和热点课题。传统的DNA损伤应答的研究主要关注蛋白因子在其中发挥的作用,随着ENCODE(encyclopedia of DNA elements)计划和高通量测序技术的发展,长非编码RNA(>200碱基)的功能逐渐受到关注。长非编码RNA通过与蛋白质、DNA或RNA的相互作用,参与多种生物学过程,如蛋白因子的募集、免疫过程的调节、基因的转录及转录后调控等。本文主要关注长非编码RNA和蛋白质在DNA损伤应答过程中的功能和机制,发现并鉴定了参与DNA损伤修复的长非编码RNA,并对其参与DNA损伤应答的分子机理开展深入的研究。(1)首先通过芯片检测紫外光及MMS(甲烷磺酸甲酯,methyl methane sulfonate)处理后非编码RNA的转录情况,分析处理后差异表达的长非编码RNA,发现其中转录变化较高的一条长非编码RNA LRIK在紫外光和MMS诱导后都表现出转录增加。敲降LRIK虽然会增加细胞对紫外光的敏感性,但是LRIK并不影响CPD(环丁烷嘧啶二聚体,cyclobutane-pyrimidine dimer)的修复速率,而是在紫外光造成的次级损伤DSB(DNA双链断裂,DNA double-strand break)的修复中发挥作用。(2)DNA双链断裂是细胞中较为严重的DNA损伤类型,LRIK在产生DSB损伤后转录应激增加,研究发现LRIK与DSB修复通路中的Ku70相互作用,共同参与DSB修复中的NHEJ(非同源末端连接修复,non-homologous end-joining)修复途径。Ku70/Ku80形成的二聚体在NHEJ的识别和起始中发挥重要作用,敲降LRIK会影响它与Ku二聚体的结合,导致Ku70/Ku80以及下游NHEJ修复蛋白如DNA-PKcs、XRCC4等结合在受损的染色质上的能力减弱,从而影响DSB修复中H2AX的磷酸化(γH2AX)形成γH2AX foci,降低了DSB的修复效率,说明LRIK在DSB识别及信号传导过程中发挥重要作用。(3)在NHEJ修复通路中,LRIK与Ku70协同发挥作用。细胞中敲降LRIK不影响NHEJ修复蛋白(Ku70、Ku80、DNA-PKcs、XRCC4)的表达水平,在细胞中表达LRIK的反义RNA来破坏LRIK与Ku70的相互作用,观察发现表达LRIK反义RNA的细胞对DSB诱导剂更加敏感,修复DSB的速率降低,并且影响γH2AX foci的形成。(4)DNA损伤后,有三种蛋白质可以对H2AX进行磷酸化,分别是ATM、ATR以及DNA-PKcs。研究发现LRIK并不影响ATM、ATR的mRNA水平和蛋白质水平,也并没有与ATM、ATR具有相互作用,因此说明,敲降LRIK不利于DNA-PKcs在受损染色质上的募集,从而影响H2AX的磷酸化和形成γH2AX foci。(5)核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是人体细胞修复紫外光线造成的损伤的主要方式,参与NER的蛋白因子的突变与多种严重疾病相关。为了探索长非编码RNA在NER中的作用,我们选取了一条只在紫外光刺激下转录升高的长非编码RNA 0301。进一步的探索发现,长非编码RNA 0301与NER通路的一个重要蛋白复合物CAK(CDK-activating kinase)中的两个亚基MAT1以及CDK7相互作用,影响紫外光处理后细胞修复CPD的水平和细胞周期的恢复,这是在NER中发现的首个参与修复的长非编码RNA。(6)银纳米颗粒(silver nanoparticle,AgNPs)由于其良好的抑菌作用被广泛应用在生活、医疗当中,与人体接触的AgNPs可以被细胞内吞进而导致DNA损伤,引起DNA损伤应答。本文的数据证实了AgNPs能被细胞内吞,内吞AgNPs后细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生显著增加。通过集落形成实验,我们发现XPF敲降细胞对AgNPs极为敏感。进一步的研究表明,敲降XPF会使细胞中的DNA损伤发生累积,进一步激活p53及其下游应答通路,引起细胞凋亡。因此,XPF蛋白在释放AgNPs带来的DNA损伤胁迫过程中发挥关键作用。