研究背景与目的宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)是一种继发于子宫内膜机械或感染性损伤的疾病。正常子宫内膜修复时不会有瘢痕形成,然而当修复机制出现异常,则会导致IUA形成。目前常采用宫腔镜下粘连分离切除术联合应用人工周期刺激子宫内膜再生的方法进行治疗,但对重度粘连的患者疗效不佳,术后往往由于宫腔创面缺乏有效阻隔,以及子宫内膜基底部受损导致修复障碍而引起粘连复发。宫腔粘连分解术后于宫腔内放置支架,能够部分阻隔宫腔创面预防再粘连,但存在分离效果有限、易引起逆行感染等问题。此外,更重要的是,重度宫腔粘连往往由于子宫内膜基底层损伤导致粘连复发。因此,研究更加安全、有效分隔宫腔创面,兼具诱导干细胞归巢修复内膜损伤的宫腔缓释支架,是治疗IUA的当务之急。材料的选择是研究宫腔缓释支架的基础。生物可降解高分子材料是组织工程领域的研究热点之一,其中,温度敏感性水凝胶能对环境温度作出智能响应,发生溶胶相(液态)与凝胶相(半固态)的可逆性转变。可在体外低温环境下保持液态,通过宫颈口注入宫腔后在体温的刺激下转变成适应宫腔形状的半固态,从而起到理想的屏障作用,且能负载生物活性因子,是宫腔内缓释材料的理想选择。近年来,有研究者把骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells BM-MSCs)作为种子细胞,移植到子宫内膜损伤的小鼠体内,发现BM-MSCs可定植于正常以及损伤的子宫内膜组织中,并可促进小鼠子宫内膜损伤部位的修复。然而此方法在临床应用中存在MSCs分离、提纯及扩增困难等问题。若通过“干细胞归巢”的方式则可避免这些问题。“归巢”描述了干/祖细胞的迁移特点,是一个多步骤协调的过程,许多细胞因子、化学因子和细胞外基质参与其中,主要是通过一系列趋化因子-趋化因子受体效应轴来实现。目前研究较广的是CXCL12-CXCR4效应轴,CXCL12(SDF-1)为低氧敏感性分子,当组织缺氧时引起SDF-1表达增高,干/祖细胞循SDF-1浓度“归巢”至损伤组织,促进组织再生和修复。1.实验方法1.1plel-bsa复合水凝胶的准备及其蛋白缓释实验我们用固体pdlla-peg-pdlla(plel)三嵌段聚合物配制了20wt%的水凝胶,升温至37℃,测试其在体温下发生溶胶相至凝胶相的转变能力。然后将牛血清白蛋白(bsa)与plel水凝胶物理混合制成plel-bsa复合水凝胶,置于37℃培养箱中,模拟体内环境,分时段收集释放的bsa,测定计算bsa的释放速率。1.2rhsdf-1α对bm-mscs的趋化作用实验分离培养并鉴定新西兰兔bm-mscs,利用transwell系统验证rhsdf-1α对bm-mscs的趋化作用。制备plel-rhsdf-1α复合水凝胶用于动物实验:11只成年新西兰雌兔(22条子宫)分为4组:自然修复组(n=6),沿子宫长轴纵形剪开,剪去子宫内膜,止血后缝合子宫纵形切口;plel治疗组(n=6),缝合后向宫腔内注射plel水凝胶;plel-rhsdf-1α治疗组(n=6),缝合后向宫腔内注射复合rhsdf-1α的plel水凝胶;假手术组(n=4),仅行开腹手术,不处理子宫,术后7天比较plel-rhsdf-1α治疗组、单纯plel治疗组mscs的归巢定植情况。1.3plel-rhsdf-1α预防宫腔粘连及促进子宫内膜再生修复的效果研究动物造模及分组同上,术后28天取子宫标本行组织切片he染色及免疫组化染色。2.实验结果2.1plel水凝胶相转变特性及plel-bsa复合水凝胶的蛋白累积释放曲线plel水凝胶在温度上升至(32-35)℃时由溶胶相转变为凝胶态。我们在体外模拟宫腔环境,将plel-bsa水凝胶凝胶化后置于37℃pbs中可保持形态超过3d,3d后发生明显溶蚀。plel-bsa复合水凝胶的蛋白累积释放曲线显示bsa缓释时间超过3d。2.2rhsdf-1α对bm-mscs的趋化作用体外bm-mscs的迁移实验显示实验组为54.330±9.424,两对照组分别为26.070±7.285及27.730±6.649,可见仅transwell小室下室加入rhsdf-1α时,bm-mscs迁移数量明显增多,与对照组比较差异均有统计学意义(p<0.05),而两对照组间无明显差异。术后7d,治疗组子宫标本cd44及cd90免疫荧光染色显示有mscs归巢至再生内膜组织,plel-rhsdf-1α治疗组归巢mscs细胞密度为(5357.7±1355.5)/mm2较plel治疗组(1496.5±650.9)/mm2约为3.6倍,差异有统计学意义(p<0.05)。2.3plel-rhsdf-1α预防宫腔粘连及促进子宫内膜再生修复的效果术后28d,自然修复组由于宫腔粘连闭塞,而plel治疗组和plel-rhsdf-1α治疗组子宫形态较规则;组织切片HE染色显示自然修复组宫腔内无上皮样组织出现,宫腔完全闭塞,而治疗组有连续的上皮样组织覆盖宫腔;上皮细胞角蛋白染色后统计内膜上皮层周长与基底层周长之比,假手术组(1.562±0.120)明显较其他各组大(P<0.05),PLEL治疗组比值(0.441±0.161)较自然修复组(0.017±0.040)大(P<0.05),而PLEL-rhSDF-1α治疗组比值(0.878±0.131)较PLEL治疗组大(P<0.05)。CD34染色后比较各组间血管密度,PLEL-rhSDF-1α治疗组(14.556±3.142)与假手术组(14.037±2.942)接近(P>0.05);两组均较自然修复组血管密度(8.778±2.847)大(P<0.05),且两组均较PLEL治疗组血管密度(9.037±2.261)大(P<0.05),而自然修复组与PLEL治疗组间无明显差异(P>0.05)。结论温度敏感性PLEL水凝胶复合rhSDF-1α具有预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复的作用。