第一部分ALDH+J肿瘤干细胞的分选及鉴定目的：从D5细胞系、SCC7细胞系、以及从D5和SCC7细胞系在小鼠体内形成的新鲜肿瘤细胞中,利用流式细胞术分选出ALDH+细胞,并对分选的细胞进行功能鉴定,为后续抗原负载树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫实验提供肿瘤干细胞(CSCs)抗原源。方法：以黑色素瘤D5和鳞状细胞癌SCC7为模型,借助于ALDEFLUOR试剂,以肿瘤细胞内ALDH活性为基础,利用流式细胞术从D5和SCC7细胞系以及由D5和SCC7细胞系在小鼠体内形成的新鲜肿瘤细胞中分选出ALDH+细胞和ALDH细胞。将分选的ALDH+和ALDH-细胞进行再次染色,分析所分选细胞的纯度。并将分选的细胞置于无血清X-vivo20培养基中培养,观察肿瘤细胞球克隆形成情况。同时还将所分选的细胞接种在小鼠体内,监测其致瘤潜能。结果：利用ALDEFLUOR试剂,成功地分离出富含干细胞的细胞群ALDH+细胞。约5%的D5和SCC7细胞系表达ALDH,而95%的细胞不表达ALDH。将D5或SCC7细胞接种在与细胞系同源的小鼠皮下,待形成约1×1cm2大小的肿瘤时,收集肿瘤组织,加入胶原酶／分散酶进行消化,收集单个的肿瘤细胞,进行ALDEFLUOR染色分析。在新鲜的D5和SCC7肿瘤细胞中,也存在约5%的细胞表达ALDH。为了评估分选的细胞的纯度,从新鲜的D5和SCC7肿瘤细胞中,将分选的ALDH+细胞和相同数量(5～15%)的ALDH细胞再次用ALDEFLUOR试剂染色分析。结果发现,分选的ALDH+细胞经再次染色后仍有90%以上的细胞表达ALDH,而分选的ALDH"细胞经再次染色后仍有90%以上的细胞不表达ALDH。肿瘤细胞球克隆形成试验发现,在两种模型中,ALDH+细胞能形成较大的、较多的肿瘤细胞球,而在相同的条件下,ALDH细胞未能或只能形成极少数的、极小的细胞集落。体内试验表明,在D5模型中即使只有500个ALDH+细胞也能形成可见的肿瘤,并能在连续移植中第二次形成肿瘤,而高达50000个ALDH-D5细胞仍未能形成肿瘤；在SCC7模型中即使是2000个ALDH+SCC7细胞也能形成肿瘤,并能在连续移植中第二次形成肿瘤；而相同数量或高达200000个ALDH" SCC7未能形成肉眼可见的肿瘤。重要的是,在这两个模型中,在免疫功能正常的宿主体内,只有ALDH+细胞在连续移植中显示致瘤潜能。结论：以ALDH为标志,在正常免疫功能小鼠体内分选的ADLH+细胞具有CSCs的特征,是高纯度的、富集CSCs的细胞群。因此,ALDH是分选D5和SCC7CSCs的可靠标志,这使我们后续在小鼠体内研究靶向CSCs诱导的抗肿瘤免疫成为可能。第二部分ALDH+肿瘤干细胞致敏树突状细胞诱导抗肿瘤免疫的体内研究目的：根据肿瘤干细胞(CSCs)理论,只有靶向清除CSCs,才有可能治愈肿瘤。这种CSCs理论也为发展新型免疫治疗奠定基础,使其治疗的目的不再只是降低肿瘤负荷,而是靶向杀伤肿瘤的“心脏”——CSCs。树突状细胞(DCs)疫苗免疫治疗通过肿瘤抗原刺激,诱导机体产生抗原特异性T细胞反应,从而发挥抗肿瘤作用。然而,现有的免疫治疗,所使用的肿瘤抗原中含有CSCs抗原极低,微量的CSCs抗原不足以诱导强烈的靶向CSCs的特异性免疫反应,因而不能有效的杀伤CSCs,可能是部分患者治疗失败的根源。本文以ALDH为标志,分选出ALDH+CSCs,探讨ALDH+CSCs致敏的DCs (ALDH+-TPDC)在抗肿瘤中的作用。方法：借助于D5和SCC7模型,在无菌条件下冲洗小鼠双侧股骨和胫骨腔,收集骨髓细胞悬液,用Ficoll-Paque PREMIUM淋巴细胞分离液,收集单个核细胞。将收集的骨髓单个核细胞用RPMI1640培养基,加入细胞因子GM-CSF(10μg/ml)和IL-4(10μg/ml),培养5天时,收集培养瓶中悬浮的细胞。用OptiPrep分离液,收集DCs。将分选的细胞经反复冻融制备ALDH+和ALDH细胞裂解物作为抗原。按DCs:CSCs以5：1的比例,向DCs悬液中分别加入ALDH+ALDH-和未经分选的细胞裂解物。同时加入细胞因子GM-CSF(10μg/ml)和IL-4(10(μg/ml)。常规培养过夜,次日收集DCs,接种于小鼠体内。在第三次接种DC疫苗的同时,在注射疫苗的对侧,分别给予每只小鼠注射D5细胞(5×106/m1)和SCC7细胞(2.5×106/ml)0.1ml,监测肿瘤生长情况。在试验终点时,收集肿瘤组织、肺组织、脾和外周血。结果：在D5模型中,与传统的未分选的肿瘤细胞裂解物负载DC疫苗(H-TPDC)相比,小鼠接受ALDH+-TPDC主动免疫后,更显著地抑制了肿瘤向肺转移(P=0.018)。这提示D5CSCs抗原具有很强的免疫原性,ALDH+-TPDC能诱导显著的保护性免疫反应。为了进一步证实此观点,我们比较了ALDH+-TPDC和ALDH细胞裂解物负载的DCs (ALDH--TPDC)诱导的保护性抗肿瘤免疫反应,用H-TPDC作为阳性对照,用PBS处理作为正常疾病进展对照。结果显示,与H-TPDC免疫和ALDH--TPDC相比,ALDH+-TPDC诱导抑制肿瘤生长的能力更强(P<0.05)。在SCC7模型中,和未接受疫苗的对照组相比,H-TPDC诱导保护性免疫抗肿瘤生长呈中度水平。相比之下,小鼠接种ALDH+-TPDC后,虽未明显延迟肿瘤的生长,但显著地抑制了肿瘤生长的进程,其生长肿瘤的体积也显著小于H-TPDC治疗组。随之,我们在SCC7模型中,从新鲜肿瘤组织中分选出ALDH+和ALDH细胞作为抗原源,重复上述试验。结果显示,与ALDH--TPDC和H-TPDC相比,ALDH+-TPDC与能诱导显著的保护性抗肿瘤免疫。在整个试验过程中,随着观察时间的延长,与PBS、H-TPDC和ALDH--TPDC相比,ALDH+-TPDC诱导的抗肿瘤作用显示的优势越明显(P<0.05)。这些数据强调了和传统的疫苗H-TPDC或ALDH--TPDC相比,来源于ALDH+CSCs疫苗抗肿瘤效果更显著。结论：与传统的疫苗H-TPDC或ALDH--TPDC相比,来源于ALDH+CSCs的疫苗抑制肿瘤生长和肿瘤转移能力更强。这就提示了在抗肿瘤免疫中,CSCs可能是最好的致敏DCs的抗原源,来源于CSCs的DCs疫苗有可能靶向消除CSCs。第三部分ALDH+肿瘤干细胞致敏的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫机制的研究目的：在我们的前期动物实验中,以ALDH为标志成功地分离和鉴定了CSCs;并且在两种动物模型中,与传统的疫苗H-TPDC或ALDH--TPDC相比,ALDH+-TPDC疫苗抑制肿瘤生长和肿瘤转移的能力更强。本研究在我们的前期动物实验基础上,继续探讨ALDH+-TPDC疫苗诱导保护性抗肿瘤免疫作用的机制。方法：从免疫治疗后宿主脾脏和外周血中分别分离淋巴细胞和单个核细胞。抗CD3(2μg/ml)、抗CD28(2μg/ml)和IL-2(60U/ml)活化T细胞,抗CD40(1：100稀释)、LPS (5μg/ml)和IL-2(60U/ml)活化B细胞。流式分析活化的T/B细胞,以检测T/B细胞的纯度。ELISA检测来自活化T/B细胞的上清及外周血的血清中IgG的含量。在D5或SCC7模型中,将不同实验组小鼠免疫血浆和分选的ALDH+细胞共孵育,流式分析各组血浆与ALDH+细胞结合的能力。同时在补体的刺激下,将实验组小鼠免疫血浆和分选的ALDH+或ALDH细胞共孵育,检测补体介导的细胞毒效应。以来自两个动物模型中各实验组外周血中的单个核细胞或脾细胞中活化的T细胞为效应细胞,以分选的ALDH+和ALDH-D5或SCC7细胞为靶细胞,采用LDH法检测细胞毒性T细胞介导杀伤肿瘤细胞的能力。结果：在D5和SCC7模型中,各实验组宿主的脾淋巴细胞经LPS/anti-CD40/IL-2活化扩增后,90%以上的细胞为B细胞；而经anti-CD3/anti-CD28/IL-2活化扩增后,90%以上的细胞为T细胞。ALDH+-TPDC疫苗处理的宿主脾淋巴细胞经LPS/anti-CD40活化后,其上清中IgG的滴度远高于来自H-TPDC治疗的脾细胞分泌的,而在anti-CD3/anti-CD28/IL-2活化的上清中,很难检测到IgG。这些数据表明ALDH+-TPDC的抗肿瘤作用与体液免疫有关。我们还发现来自D5ALDH+-TPDC治疗宿主的血清能高特异性结合ALDH+CSCs而来自D5H-TPDC治疗或PBS治疗宿主的血清结合ALDH+CSCs能力较低,分别为30.6%和26.4%。在SCC7模型中得到类似的结果：SCC7ALDH+-TPDC治疗的宿主血清能结合26.4%ALDH+CSCs,显著高于SCC7H-TPDC治疗(4.0%)或PBS治疗(0.9%)的宿主血清结合CSCs的能力。在补体的作用下,免疫血清来自D5或SCC7ALDH+-TPDC治疗宿主的免疫血浆显著地杀伤了D5或SCC7ALDH+CSCs细胞,其杀伤能力显著高于来自H-TPDC和PBS处理宿主的血浆。更重要的是,宿主外周血中T细胞介导了显著的CTL效应。D5ALDH+-TPDC组外周血中T细胞诱导的CTL杀伤D5ALDH+CSCs(约60%)显著高于D5H-TPDC组(约20%)(P=0.003)。SCC7ALDH+-TPDC组外周血中T细胞诱导的CTL杀伤SCC7ALDH+CSCs(约60%)显著高于SCC7H-TPDC组(约20%)(P=0.001),或SCC7ALDH--TPDC组(约25%)(P=0.002)。脾细胞中淋巴细胞和外周血中淋巴细胞诱导的CTL效应相似,D5ALDH+-TPDC组脾脏T细胞致敏的CTL杀伤D5ALDH+CSCs的能力(P<0.01在所有E：T)显著高于对D5ALDH-非CSCs的作用。此外,我们还观察了宿主肿瘤组织中,残留的ALDH+CSCs含量。结果表明,在两个动物模型中,ALDH+-TPDC显著降低了宿主体内残留的ALDH+CSCs含量。而且与对照组相比,ALDH+-TPDC也显著降低了宿主体内残留ALDH+CSCs的相对含量,分别高达60.7%和73.5%。结论：ALDH+CSCs负载的DCs疫苗诱导的保护性抗肿瘤免疫显著优于传统的全肿瘤细胞负载的DCs疫苗,其作用机制是通过激活宿主体内细胞免疫和体液免疫,特异性靶向杀伤宿主体内ADLH+CSCs。这些结果为靶向消除CSCs的免疫治疗提供理论依据。