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研究背景:急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一类起源于造血干细胞祖细胞（hematopoietic stem progenitor cells,HSPCs）的血液系统恶性疾患,主要体现在髓系干祖细胞恶性增殖,分化受阻及凋亡紊乱,致使正常造血功能受到严重的破坏。AML的发病率逐年增加,并且5年生存率远低于百分之五十。迄今为止,化疗作为AML治疗的主要手段已取得较大进展,但是由于耐药现象的存在,多数患者仍出现难治、复发,最终导致治疗失败。目前,AML的耐药机制尚不完全明确,影响耐药的因素及其机制有待进一步研究。硫化氢（H2S）是继一氧化碳和一氧化氮后重要的气体信号分子,在哺乳动物体内经胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）合成。CBS/H2S信号在消化系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系统及泌尿系统等中都有表达。并且,CBS/H2S信号在肿瘤发生发展、神经传递、氧化还原、感染、胰岛素分泌及心血管保护等方面具有重要作用。新近多项研究表明,CBS/H2S信号在肿瘤组织中过表达,此信号促进肿瘤细胞增殖,且能够降低对化疗药物的敏感性。然而,CBS/H2S信号在造血系统恶性疾患中的作用及其机制尚未报道。本课题旨在探究AML细胞中CBS/H2S信号的表达情况,通过体内、体外实验探究CBS/H2S信号对AML耐药以及疾病进展的影响,预期目标的实现将为AML的治疗提供新的靶点。研究目的:检测CBS在AML耐药细胞系、AML细胞系和正常骨髓细胞中的表达水平及H2S在AML耐药细胞系、AML细胞系和正常骨髓细胞中的产量,通过上调或者下调AML细胞系中CBS/H2S信号,研究此信号对AML细胞系耐药、增殖等生物学行为的影响,分析CBS/H2S信号与耐药的关系;构建AML小鼠模型,通过体内实验进一步证实CBS/H2S信号在AML耐药及发生发展中作用,为难治、复发AML提供新的科学依据和治疗靶点。研究方法:1.Western blot法检测CBS表达水平:应用总蛋白细胞裂解液分别提取人AML耐药细胞系（K562/A02）、人AML细胞系（THP-1、HL60、U937、K562）以及鼠AML细胞系（C1498）、鼠正常骨髓细胞系（32D）、鼠正常骨髓细胞的总蛋白,应用Westernblot方法检测细胞中CBS的表达水平。2.H2S释放实验检测H2S产量:采用超声匀浆仪将人AML耐药细胞系（K562/A02）、人AML细胞系（THP-1、HL60、U937、K562）以及鼠AML细胞系（C1498）、鼠正常骨髓细胞充分匀浆,获取匀浆液,应用H2S释放实验检测细胞H2S产量。3.CCK-8法检测AML细胞的增殖情况:3.1应用氨基羟乙酸（AOAA）或CBS-SiRNA下调AML细胞CBS/H2S信号,CCK-8法检测AML细胞增殖情况;3.2应用药物方法（硫氢化钠,NaHS）上调AML细胞CBS/H2S信号,CCK-8法检测AML细胞增殖情况;3.3下调AML细胞CBS/H2S信号后,外源性加入硫氢化钠,CCK-8法检测AML细胞增殖情况。4.CCK-8法检测AML细胞的化疗药物敏感性的改变:4.1应用常规化疗药物作用于下调CBS/H2S信号的AML细胞,CCK-8法检测AML细胞对化疗药物敏感性的改变;4.2应用常规化疗药物作用于上调CBS/H2S信号的AML细胞,CCK-8法检测AML细胞对化疗药物敏感性的改变;4.3应用常规化疗药物作用于下调CBS/H2S信号的AML细胞,再外源性加入硫氢化钠,CCK-8法检测AML细胞对化疗药物敏感性的改变;4.4应用常规化疗药物作用于野生型小鼠或者CBS小鼠骨髓细胞,CCK-8法分别检测骨髓细胞对化疗药物的敏感性。5.构建AML小鼠动物模型:采用小鼠AML细胞系（C1498）,通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内。观测肝、脾重量,肝脏、脾脏以及骨髓组织切片,外周血白细胞计数及生存状态等鉴定AML小鼠模型。6.体内研究CBS/H2S信号对AML疾病进展的影响:6.1应用药物方法（氨基羟乙酸,AOAA）下调AML小鼠动物骨髓细胞中CBS/H2S信号,（1）观测AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）观察AML小鼠肝、脾以及骨髓组织切片,（3）检测AML小鼠血常规,统计外周血白细胞计数,（4）记录AML模型小鼠生存期,绘制生存曲线;6.2应用药物方法（H2S缓释剂,GYY4137）上调AML小鼠动物体内CBS/H2S信号,（1）观测AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）观察AML小鼠肝脏、脾脏以及骨髓组织切片,（3）检测AML小鼠外周血白细胞计数,（4）记录AML小鼠生存期,绘制生存曲线;6.3通过尾静脉注射小鼠AML细胞系（C1498）构建CBS+-/-AML小鼠,（1）观测敲基因AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）观察敲基因AML小鼠肝、脾脏以及骨髓组织切片,（3）检测敲基因AML小鼠外周血白细胞计数,（4）记录敲基因AML小鼠生存期,绘制生存曲线;6.4综合以上结果,分析CBS/H2S信号对AML疾病进展的影响。7.体内研究CBS/H2S信号对AML耐药性的影响:7.1应用常规化疗药物作用于下调CBS/H2S信号的AML小鼠,（1）观测AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）检测AML小鼠血常规,统计外周血白细胞计数,（3）记录AML小鼠生存期,绘制生存曲线;7.2应用常规化疗药物作用于上调CBS/H2S信号的AML小鼠,（1）观测AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）检测AML小鼠血常规,统计外周血白细胞计数,（3）记录AML小鼠生存期,绘制生存曲线;7.3应用常规化疗药物作用于CBS+/-AML小鼠,（1）观测敲基因AML小鼠肝、脾肿大情况及重量,（2）检测敲基因AML小鼠血常规,统计外周血白细胞计数,（3）记录敲基因AML小鼠生存期,绘制生存曲线;7.4综合以上结果,分析CBS/H2S信号对AML耐药性的影响。研究结果:1.Western blot法检测AML细胞中CBS表达水平及H2S释放实验法检测AML细胞中H2S产量,结果显示:在人AML细胞系中,耐药细胞（K562/A02）过表达CBS/H2S信号;在鼠AML细胞系和正常骨髓细胞中,AML细胞系表达CBS/H2S信号,而鼠正常骨髓细胞不表达或较少表达CBS/H2S信号;在K562/A02细胞系中,CBS-SiRNA可显著下调CBS/H2S信号的表达。2.CCK-8法检测AML细胞的增殖情况,结果显示:应用AOAA或CBS-SiRNA下调AML细胞CBS/H2S信号后,AML细胞增殖率明显降低;应用硫氢化钠上调AML细胞CBS/H2S信号后,AML细胞增殖率明显增高;下调AML细胞CBS/H2S信号后,再外源性加入硫氢化钠,硫氢化钠能够逆转因CBS/H2S信号下调导致的细胞增殖率降低的效应。3.CCK-8法检测AML细胞的耐药性改变的结果显示:应用AOAA或CBS-SiRNA下调AML细胞CBS/H2S信号后,AML细胞对化疗药物的敏感性明显增强;应用硫氢化钠上调AML细胞CBS/H2S信号后,AML细胞对化疗药物的敏感性明显降低;下调AML细胞CBS/H2S信号后,再外源性加入硫氢化钠,硫氢化钠能够逆转因CBS/H2S信号下调导致的细胞耐药性降低的效应;应用化疗药物作用于野生型小鼠或者CBS+/-小鼠骨髓细胞后,发现CBS+/-IH 鼠骨髓细胞对化疗药物的敏感性高,野生型小鼠敏感性低。4.通过尾静脉注射C1498细胞至C57BL/6小鼠体内构建AML小鼠模型:AML模型小鼠外周血白细胞计数显著增高;AML模型小鼠肝、脾显著肿大,重量明显增加;AML模型小鼠肝、脾和骨髓组织切片可见大量白血病细胞浸润;AML模型小鼠在一月内死亡。5.体内研究CBS/H2S信号对AML疾病进展的影响结果显示:（1）应用AOAA或CBS+/-小鼠下调AML小鼠动物骨髓细胞内CBS/H2S信号后,①小鼠肝、脾肿大程度及重量相对于对照组小鼠减轻,②组织切片显示肝、脾及骨髓组织中白血病细胞浸润程度减轻,③外周血中白细胞数量相对少,④生存期相对延长（AOAA组:43天,CBS+/-小鼠组:41天,对照组:26天）;（2）应用GYY4137上调AML小鼠动物体内CBS/H2S信号后,①小鼠肝、脾肿大程度及重量相对于对照组小鼠较重,②组织切片示肝、脾及骨髓组织中AML细胞浸润程度重,③外周血中白细胞数量相对多,④生存期相对缩短（GYY4137组:18天,对照组:26天）。6.体内研究CBS/H2S信号对AML耐药的影响结果显示:（1）应用AOAA或CBS+/-小鼠下调AML细胞CBS/H2S信号后,下调CBS/H2S信号的AML小鼠对化疗药物的敏感性明显增强:①小鼠肝脾肿大程度及重量相对较轻,②外周血白细胞计数显示外周血中白细胞数量相对少,③生存期相对延长（AOAA组:72天,CBS+/-小鼠组:65天,对照组:54天）;（2）应用GYY4137上调AML细胞CBS/H2S信号后,上调CBS/H2S信号的AML小鼠对化疗药物的敏感性明显降低:①小鼠肝脾肿大程度及重量相对较重,②外周血白细胞计数显示外周血中白细胞数量相对多,③生存期相对缩短（GYY4137组:31天,对照组:54天）。结论:1.CBS/H2S信号在AML细胞中高表达,且在AML耐药细胞系中表达更高,提示CBS/H2S信号可能参与AML的耐药和发生发展过程,在判断AML患者预后及AML治疗方面具有重要意义。2.下调CBS/H2S信号可抑制AML细胞的耐药性和增殖,上调CBS/H2S信号可促进AML细胞的耐药性和增殖,提示CBS/H2S信号在AML的耐药和发生发展中具有重要作用。3.通过体内实验证实,下调CBS/H2S信号可抑制AML模型小鼠耐药性和疾病进展,上调CBS/H2S信号可促进AML模型小鼠耐药性和疾病进展,所以抑制CBS/H2S信号表达可能成为逆转AML耐药的新靶点。