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腰痛(low back pain,LBP)是导致现代人活动功能障碍,影响生活质量的常见原因,现阶段临床尚缺乏有效的治疗手段。椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVD)被认为是导致腰痛的重要原因,但其确切发病机制并不清楚。既往研究表明炎症因子与椎间盘退变诱导的盘源性腰痛密切相关,白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)是其中研究较为广泛的一个因子。但IL-1β对人退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡和分解代谢的影响及其调控机制尚缺乏系统研究。本课题拟从IL-1β通过线粒体途径诱导NPCs凋亡;IL-1β介导的线粒体损伤激活了NPCs自噬;自噬抑制IL-1β诱导的NPCs凋亡;SIRT1通过TLR2/NF-κB信号通路抑制IL-1β对胞外基质的分解作用四个方面分别进行阐述。第一部分IL-1β通过线粒体途径诱导NPCs凋亡目的探讨IL-1β是否通过线粒体途径介导退变NPCs凋亡。方法将来自于正常和退变组的髓核组织,采用western blot、免疫组化和TUNEL染色分别原位比较IL-1β表达和细胞凋亡情况。采用酶序贯消化法分离、培养退变组的髓核细胞。以不同浓度IL-1β作用后,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8检测细胞增殖以此筛选最佳作用浓度。分别采用大体形态观察、Hoechst 33258染色和流式细胞术检测血清存在与否对IL-1β诱导NPCs凋亡是否存在影响。Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Bax、Bcl-2和细胞色素C;DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS表达量;酶标仪测定线粒体凋亡通路最后执行蛋白caspase-3和caspase-9酶活性。结果退变髓核组织中IL-1β表达和细胞凋亡数均要显著高于正常组(P﹤0.05),提示IL-1β高表达与退变髓核中细胞凋亡增高存在联系。筛选出10ng/ml浓度IL-1β为最佳亚致死剂量。在血清剥夺条件下,IL-1β可以明显诱导NPCs凋亡(P﹤0.05),但正常培养条件下血清可以中和IL-1β的细胞毒性作用。IL-1β可以明显诱导Bax/Bcl-2蛋白表达比增高(P﹤0.05),以及促进Cyt C从线粒体释放入胞质中,提示线粒体凋亡通路被激活;ROS和caspase酶活性检测进一步表明,IL-β作用可以明显提高NPCs内ROS表达(P﹤0.05),以及显著提高caspase-3和caspase-9酶活性(P﹤0.05)。结论IL-1β在无血清条件下,可以通过线粒体途径明显诱导退变NPCs凋亡。第二部分IL-1β介导的线粒体损伤激活了NPCs自噬目的探讨IL-1β对NPCs的线粒体是否具有直接损伤作用,损伤的线粒体能否进一步激活自噬。方法以10%FBS正常培养组作为对照,在血清剥夺条件下加或不加10ng/ml IL-1β刺激,采用JC-1染色检测线粒体膜电位,ATP检测试剂盒测定细胞内ATP合成量,透射电镜直接观察线粒体超微结构,直接判断IL-1β对线粒体损伤的作用。另一方面,Western blot测定自噬相关蛋白LC3和P62;为了更加直接观察IL-1β对自噬的影响,采用含GFP-LC3腺病毒转染NPCs,观察绿色荧光斑点数,以此判断自噬激活器情况;为了进一步验证IL-1β对自噬的激活作用是因为激活了“自噬流”还是阻碍了自噬的降解,采用自噬的抑制剂0.1μmol/L Bafilomycin A1(BAF)预处理2h再检测LC3和P62的表达;最后采用经典透射电镜观察自噬体判断在IL-1β作用下NPCs内自噬的表达情况。结果在血清剥夺条件下可以导致线粒体膜电位适度下降,但一旦加入IL-1β作用,膜电位则进一步显著降低(P﹤0.05);虽然0%FBS培养条件下ATP合成量与对照组无明显差别(P﹥0.05),但IL-1β显著降低了ATP合成(P﹤0.05);电镜观察结果显示0%FBS组线粒体形态发生肿胀或空泡样变性;而在IL-1β炎性刺激下,线粒体形态进一步改变,发生基质固缩,线粒体内嵴断裂,外膜完整性消失。上述结果提示IL-1β可以明显诱导线粒体发生损伤。进一步研究结果显示,IL-1β作用下显著提高了LC3-II/LC3-I蛋白表达比,而降低了P62表达,提示IL-1β可以激活退变NPCs内细胞自噬。GFP-LC3激光共聚焦结果进一步证实,IL-1β处理后细胞内绿色荧光斑点数显著增多。接着采用BAF处理后,western blot结果显示LC3-II/LC3-I表达比和P62蛋白表达均显著上升(P﹤0.05),由此证明IL-1β激活了NPCs自噬流爆发,而非阻碍了自噬的降解。透射电镜直接观察结果表明0%FBS+IL-1β组观察到不仅自噬体数量增多,还可以在个别自噬-溶酶体内观察到尚未被完全消化的线粒体结构,进一步证明了IL-1β介导的自噬具有清除损伤线粒体的作用。结论IL-1β介导了退变NPCs线粒体损伤,并进一步激活了自噬。第三部分自噬抑制IL-1β诱导的NPCs凋亡目的探讨IL-1β所激活的自噬对NPCs凋亡影响。方法采用自噬的特异性抑制剂3-MA(5mmol/L)预处理NPCs后,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1染色检测对线粒体膜电位影响。为进一步验证IL-1β所激活的自噬是否为代偿性的线粒体自噬(mitophagy),western blot分别检测了mitophagy的关键诱导蛋白Parklin的线粒体和胞质表达。采用自噬激动剂RAP(50nmol/L)预处理后,同时转染Ad-GFP-LC3和Ad-HBm Tur-Mito腺病毒,其中GFP-LC3标记自噬体,而HBm Tur-Mito标记线粒体,转染后通过激光共聚焦观察共定位情况,以此判断是否发生了线粒体自噬。结果3-MA抑制NPCs中自噬活性后,细胞凋亡显著增加(P﹤0.05),线粒体膜电位则进一步降低(P﹤0.05),说明自噬被抑制后,NPCs线粒体功能受到了进一步破坏。加入IL-1β刺激后发现Parkin在线粒体上的表达明显上升(P﹤0.05),而在胞质中的表达明显下降(P﹤0.05),说明其发生了线粒体转位,提示诱导了mitophagy。而加入自噬激动剂RAP后,黄色荧光斑点进一步增多,证明IL-1β所激活的自噬与线粒体自噬有关。结论IL-1β介导的自噬激活,具有代偿性保护NPCs凋亡作用,部分参与了线粒体自噬地发生。第四部分SIRT1通过TLR2/NF-κB信号通路抑制IL-1β对胞外基质分解作用目的探讨在IL-1β促分解作用下,SIRT1对ECM的调控作用及其潜在机制。方法将来自于正常和退变组的髓核组织,采用免疫组化检测SIRT1、MMP-3和MMP-13原位表达,western blot检测各个髓核组织中SIRT1、II型胶原和aggrecan蛋白表达差异。采用SIRT1过表达慢病毒和SIRT1-si RNA慢病毒靶向调控NPCs中SIRT1表达,探讨对ECM的表达调控作用。采用western blot、免疫共沉淀和细胞免疫荧光进一步探讨SIRT1是否通过TLR2/NF-κB信号通路参与了ECM表达调控。结果组织的免疫组化和western blot结果显示SIRT1在退变髓核髓核中表达明显下降,而基质降解酶MMP-3和MMP-13表达明显升高,伴随着ECM主要成分COL2A1和aggrecan表达降低。这一结果提示SIRT1与ECM表达之间存在密切联系。采用慢病毒靶向调控SIRT1表达后发现,SIRT1过表达可以明显抑制IL-1β对COL2A1和aggrecan地降解作用,而沉默SIRT1表达可以明显增加MMP-3和MMP-13表达。提示SIRT1能够抑制IL-1β对ECM降解作用。进一步探讨其潜在机制发现,在加入IL-1β刺激后,TLR2-NF-κB通路被激活,免疫共沉淀显示SIRT1与P65之间存在相互作用关系,SIRT1过表达后,TLR2以及P65的总蛋白、乙酰化蛋白表达均降低。此外,当P65表达降低后,MMP-3和MMP-13的表达也随之降低。免疫荧光显示IL-1β所诱导的P65核转位,并不受TLR2表达沉默的影响。由此我们初步揭示了在IL-1β作用下SIRT1与TLR2-NF-κB通路相互关系。结论SIRT1通过TLR2/NF-κB信号通路抑制IL-1β对胞外基质分解作用。