论文部分内容阅读
背景：造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)存在于骨髓、胚胎肝、脾脏、外周血及脐带血等多种组织部位,是生成各种血细胞的起始细胞,并具有高度自我更新能力。在临床上,HSC已广泛和有效的应用于干细胞移植、生物免疫治疗和造血支持治疗等领域。但影响HSC自我更新及多向分化的机制还有待研究。Notch受体在造血干、祖细胞高表达,但Notch信号通路影响HSC自我更新和多向分化的机制还不清楚。我们实验室前期工作提示Notch可以下调细胞周期抑制蛋白p18。本研究拟通过Notch受体激活所必需的胞内片段切割酶y-Secretase抑制化合物DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L:-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester)和p18蛋白阻断剂(3#小分子化合物)分别及共同作用于小鼠骨髓HSC,系统深入研究Notch信号通路影响HSC的机制,为HSC体外扩增和HSC的骨髓移植提供新的科学依据(图1)。目的：研究Notch-p18信号通路对HSC功能的影响。方法：(1)DAPT体外作用小鼠骨髓细胞,研究Notch信号通路对HSC功能的影响。DAPT阻断小鼠骨髓细胞的Notch信号通路后,用RT-PCR检测小鼠骨髓HSC的细胞周期和细胞凋亡相关基因表达量变化；流式细胞仪分析检测小鼠骨髓HSC的细胞周期和细胞凋亡变化；单个HSC培养实验检测HSC的增殖及分化能力的变化以及体外长周期培养实验检测HSC的扩增潜能。(2)p18蛋白抑制剂处理小鼠骨髓细胞,研究p18抑制剂对小鼠骨髓HSC的影响。流式细胞仪分析检测小鼠骨髓HSC的细胞周期及细胞凋亡的变化；用RT-PCR检测小鼠骨髓HSC中细胞周期相关基因mRNA表达量的变化；活细胞工作站观察小鼠骨髓HSC分裂时间的变化。(3)我们采用DAPT和p18蛋白抑制剂分别及共同作用于与MS5-Deltal细胞系共培养的小鼠骨髓细胞,进一步研究Notch-p18信号通路在HSC的调控中的作用。MS5-Deltal细胞系(Deltal为Notch受体的配体)与小鼠骨髓细胞共培养,可激活Notch信号通路。利用DAPT和p18蛋白抑制剂分别及共同作用于以MS5-Deltal细胞系为基质共培养的小鼠骨髓细胞,体外长周期培养实验检测小鼠骨髓HSC活性的变化、单个HSC培养实验检测HSC分化能力的变化及竞争性骨髓移植实验检测HSC重建能力的变化；RT-PCR检测小鼠骨髓HSC中Notch信号通路相关基因Notch1、CSL、HES1和p18mRNA表达量的变化。结果：(1)1μM的DAPT可有效阻断Notch受体胞内段的切割。RT-PCR结果显示：DAPT作用于LKS细胞,小鼠骨髓细胞中细胞周期相关基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6及p27的mRNA表达量升高,p18和p21基因的mRNA表达量降低,凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p53、Puma的mRNA表达量升高,Bim基因的mRNA表达量降低。DAPT处理小鼠骨髓细胞,流式细胞仪分析检测结果为：CD34-Lin-c-kit+Sca-1+(CD34-LKS)细胞的Go期细胞减少,G1期细胞增多；HSC的细胞凋亡增多。体外长周期培养实验证明HSC的扩增能力下降。(2)20μM的p18抑制剂(3#小分子化合物),可有效作用于小鼠骨髓细胞。p18抑制剂处理骨髓细胞后,流式细胞仪分析检测发现小鼠骨髓HSC的细胞周期及细胞凋亡无变化。LKS细胞加p18抑制剂处理后,RT-PCR结果显示CDK2、CDK6基因的mRNA表达量升高；活细胞工作站发现p18抑制剂加速了单个HSC子细胞分裂,缩短了子细胞的分裂时间的间隔。(3)1μM的DAPT和20μM的p18抑制剂分别及同时作用于以MS5-Deltal细胞系为基质共培养的小鼠骨髓细胞,体外长周期培养实验证明p18抑制剂组HSC的扩增能力增强,DAPT组HSC的扩增能力下降,p18抑制剂和DAPT组HSC的扩增能力增强,但低于p18抑制剂组,高于DAPT组。单个HSC与DAPT、p18抑制剂或二者共同培养十天,实验结果显示p18抑制剂促进HSC向单核和巨噬细胞方向分化,DAPT促进其向粒细胞方向分化。竞争性骨髓移植实验说明,在移植一个月后,各组之间供体细胞的重建率和供体细胞的各系分化情况没差别。RT-PCR结果显示：小鼠骨髓LKS细胞加DAPT处理后,HES1基因的mRNA表达量降低,p18基因的mRNA表达量升高,细胞周期相关基因p21、CDK1、CDK4的mRNA表达量升高。小鼠骨髓LKS细胞加p18抑制剂处理后,Notch1、CSL、 HES1、p18基因的mRNA表达量不变。小鼠骨髓LKS细胞加p18抑制剂和DAPT同时处理后,HES1基因的mRNA表达量降低,p18基因的mRNA表达量升高。结论：(1) DAPT阻断Notch信号通路后,加速了小鼠骨髓HSC的耗竭及凋亡,降低了小鼠骨髓HSC的扩增能力。(2)p18蛋白抑制剂对小鼠骨髓HSC的细胞周期及细胞凋亡无影响。(3) Notch信号通路可能是通过上调HES1表达,进而下调p18蛋白表达来调节小鼠骨髓HSC功能的。