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本文研究内容主要有:ACE抑制活性体外检测方法的建立;海地瓜蛋白酶解工艺的确定及酶解液的慢性降压效果研究;海地瓜ACE抑制肽的分离纯化及结构鉴定;ACE抑制肽的设计合成及特性研究。本文建立了适用于检测食源性ACE抑制肽体外活性的RP-HPLC法。该方法操作简便,重复性好,准确性高。应用该方法对马尿酸浓度与峰面积的相关性进行分析,结果表明马尿酸浓度在0～200μg/mL和200～800μg/mL范围内与峰面积呈现良好的相关性。马尿酸浓度小于200μg/mL时,其重复性最好。经卡托普利、牡蛎酶解液、鳀鱼酶解液验证,表明该方法适用于食源性ACE抑制肽体外活性的测定和化学合成的降压药物。本文研究了海地瓜蛋白的定向复合酶解工艺。以海地瓜蛋白为原料,选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、3942中性蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、alcalase蛋白酶对其进行水解。以单酶水解产物的IC50值为评价指标,确定了菠萝蛋白酶、alcalase蛋白酶、Ⅰ型胶原酶作为目标酶。通过正交实验,确定了这三种单酶的最适水解条件。结果表明:菠萝蛋白酶最适水解条件为:45℃,pH 7.0,底物浓度1.0%,2000 U,4 h;alcalase蛋白酶最适水解条件为:55℃,pH 7.4,底物浓度1.5%,2000 U,2 h;Ⅰ型胶原酶最适水解条件为:37℃,pH 7.4,底物浓度1.0%,1500 U,4 h。在单酶和正交实验的基础上,采用复合酶进行水解实验,得到了最适复合酶水解工艺条件:先采用菠萝蛋白酶进行水解,再用alcalase蛋白酶水解。复合酶水解液分别经过10 KDa、5 KDa、2 KDa的膜超滤,得到了具有更高抑制活性的ACE组分,优化了复合酶解工艺,其水解液的IC50值为0.62 mg/mL。本文采用两肾一夹型造模手术,成功得到了肾性高血压大鼠。通过长期给药的试验表明,分子量小于2 KDa的海地瓜蛋白水解产物可以显著降低肾性高压大鼠的动脉血压,具有较好的降压效果,且呈剂量依赖性,其中120 mg/kg剂量水解产物的降压效果与卡托普利10 mg/kg相当。本文利用Sephadex G-25凝胶柱层析、SP Sephadex C-25阳离子交换层析、反相高效液相色谱层析对海地瓜复合酶水解产物进行分离纯化,得到两种高活性的ACE抑制肽-P1(IC50, 0.0496 mg/mL)和P2(IC50, 0.0165 mg/mL),它们的活性分别为复合酶水解液的12.5倍和37.6倍。用反相高效液相色谱C18分析柱鉴定活性肽P1和P2的纯度,按照峰面积计算,活性肽P1的纯度为98.6%,活性肽P2的纯度为100%。应用纳升电喷雾—四极杆—飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/Ms)技术,对活性肽P1、P2进行结构鉴定。P1的精确分子量为1629.7 Da,氨基酸序列为YYLEMDFLLFNY,IC50值为30.4μM;P2的精确分子量为1034.5 Da,氨基酸序列为MEGAQEAQGD,IC50值为15.9μM。本文采用逐步缩合和片断缩合相结合的方法对海地瓜ACE抑制肽MEGAQEAQGD进行了设计合成。首先合成了该十肽的三个片段QGD、QEA、MEGA,然后按照(3+3+4)片段缩合策略最终合成出了MEGAQEAQGD。该十肽的纯度为99.72%,收率为68.2%,分子量与序列结构均与理论值相符。本文研究了海地瓜ACE抑制肽MEGAQEAQGD的特性。研究发现,ACE酶不会影响抑制肽的稳定性。但是,抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后,活性却增强了3.5倍,这说明抑制肽属于前体药物型的ACE抑制剂。动物实验表明,灌胃抑制肽(3μM/kg)3个小时后,降压效果最好,自发性高压大鼠的收缩压从192±1.7 mmHg下降到173±2.9 mmHg,并且该活性能持续5个小时。卡托普利组(3μM/kg)只在1-4小时内有明显的降压效果。口服给药4个小时后,抑制肽的降压效果明显好于卡托普利(P < 0.01)。