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研究目的探讨膜联蛋白A2(ANXA2)在人视网膜血管内皮细胞(HRECs)中的作用及机制,为视网膜新生血管相关疾病的预防和治疗寻找新靶点。研究方法选取64只健康C57BL/6J小鼠,随机分为对照组和实验组各32只,实验组利用高氧诱导法构建经典的氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型,对照组无处理,利用凝集素GS-IB4荧光染色技术观察小鼠视网膜新生血管(RNV)情况,利用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,验证OIR小鼠模型构建是否成功;利用Western Blot,RT-PCR,检测小鼠视网膜中ANXA2的表达情况,以验证ANXA2在体内视网膜新生血管病变中的作用。利用干扰ANXA2组质粒(对照组:shNC,实验组:shA2)和过表达ANXA2组质粒(对照组:lenti-EGFP,实验组:lenti-A2)包装为慢病毒感染人视网膜血管内皮细胞(HRECs),利用Western Blot和RT-PCR检测在HRECs中是否成功干扰和过表达ANXA2。通过EdU细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验和Matrigel基质胶管样形成实验检测ANXA2对HRECs形成新生血管功能的影响。采用流式细胞仪检测ANXA2对HRECs细胞周期的影响,并用Western Blot检测一系列细胞周期相关蛋白的表达水平。利用基因芯片技术分析ANXA2在基因水平调控HRECs的分子表达谱差异,用RT-PCR验证基因芯片中表达较为稳定分子,利用Western Blot和核蛋白提取技术检测头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)、核因子κB(NFκB)亚基p65蛋白的表达水平,探讨ANXA2对CYLD和NFκB信号通路的影响。研究结果本实验构建的OIR小鼠模型视网膜与正常小鼠视网膜相比,新生血管迂曲扩张分布杂乱,血管分层不清且HIF-1α的基因和蛋白表达水平明显升高(mRNA t=25.57,P<0.0001),成模率达81%。同时我们发现OIR组中ANXA2的基因和蛋白表达水平明显提高(mRNA t=26.58,P<0.0001)。同阴性对照组相比,干扰ANXA2后ANXA2的基因和蛋白表达水平均降低(mRNA t=5.248,P=0.0063),过表达ANXA2后ANXA2的表达水平均升高(mRNA t=28.95,P<0.0001)。干扰ANXA2后HRECs细胞增殖量、细胞迁移量和细胞管状结构明显减少(t=10.23,P=0.0005;t=11.27,P=0.0004;t=15.37,P=0.0001),而过表达ANXA2后其三者量均增加(t=3.21,P=0.0326;t=20.19,P<0.0001;t=7.155,P=0.0020)。流式细胞仪检测结果采用ModFit software软件分析,与阴性对照组相比,干扰ANXA2后处于G1期的细胞数量增加,S期细胞数量减少(t=5.01,P=0.0074;t=4.51,P=0.0107),而过表达ANXA2后处于G1期的细胞数量减少,S期细胞数量增加(t=4.275,P=0.0129;t=4.915,P=0.0080);细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4和CDK6的蛋白在干扰ANXA2后表达水平减少(t=2.835,P=0.0471;t=3.434,P=0.0264;t=7.317,P=0.0019),过表达ANXA2后表达水平增加(t=4.147,P=0.0143;t=4.009,P=0.016;t=6.710,P=0.0026),而CyclinA1、CyclinB1、CyclinE1和CDK2的表达水平没有明显变化。同阴性对照组相比,干扰ANXA2后CYLD的基因和蛋白表达水平均升高(t=8.44,P=0.0011;t=9.848,P=0.0006),过表达ANXA2后CYLD的表达水平均降低(t=12.11,P=0.0003,t=6.054,P=0.003)。由于CYLD为NFκB信号通路的主要负向调节因子,我们检测了与NFκB信号通路有关的蛋白表达,发现同对照组相比,干扰ANXA2后IκBα磷酸化和核内p65的蛋白表达量均减少(t=7.29,P=0.0019;t=4.901,P=0.008),过表达ANXA2后两者表达量均增多(t=3.474,P=0.0255;t=6.069,P=0.0037)。研究结论膜联蛋白A2能够促进人视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和管样形成,可能是通过调节HRECs细胞周期中G1-S期的转化和抑制去泛素化酶CYLD的活性,激活NFκB信号通路来发挥作用。