DNA疫苗是一种能够作为疫苗使用的DNA序列。这一序列来自于病原体,编码病原体的蛋白。将此序列克隆到真核表达载体上并将构建的重组质粒注入到宿主体内,并使外源基因得以表达,从而激活机体免疫系统,引发抗体反应,可以达到消灭病原体的目的。DNA疫苗的发展被称为疫苗研究的一次革命,在现代疫苗研究中发挥越来越主要的作用。然而,DNA疫苗本身的免疫应答水平很低,往往难以达到预期的目的。高效、特异地将DNA疫苗导入到抗原递呈细胞中并使它得到高效表达是提高DNA疫苗免疫活性的根本途径。DNA递送载体可将DNA疫苗递送到APC中,增加抗原提呈水平和疫苗的免疫应答水平。细菌菌蜕(bacterial ghost,BG)是使用裂解酶将细菌裂解、去除菌体内容物之后形成的空腔。BG保留了菌体的细胞壁结构的完整性和抗原特性,可以增强机体对外来抗原的免疫应答,且本身有可能作为疫苗在对抗病原体的过程中发挥作用。此外,BG周质腔内膜和外膜相互链接一个具有完整的细胞膜结构,可用于装载质粒DNA。BG还能够被宿主DC识别、吞噬,靶向性将DNA疫苗导入DC细胞,增强DNA疫苗的免疫活性。抗原提呈细胞(antigen present cell,APC)的抗原提呈效率也是决定其免疫活性的关键因素。研究表明MHC-Ⅱ的分子伴侣恒定链(invariant chain, Ii)在抗原提呈通路中发挥重要作用。MHC-Ⅱ在与多肽结合之前,抗原结合槽一直被Ii链的CLIP占据。如果用抗原表位替代CLIP,就能够让外源的抗原表位靶向性地进入MHCⅡ的抗原结合槽,直接将表达的抗原提呈给效应细胞,从而大大提高抗原提呈效率,这种方法被称作内源性靶向。本课题拟以BG为载体制备双重靶向DNA疫苗:首先利用BG将DNA疫苗靶向性的导入树突状细胞(DC)、并获得高效表达;其次将编码抗原的基因片段构建在Ii载体中,内源靶向性地将表达产物递交给MHC-Ⅱ分子,进一步提高抗原提呈能力和免疫应答水平。为验证这一疫苗设计的新策略,拟以文献报道口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位序列为靶点,观察BG装载的双重靶向疫苗导入巨噬细胞系和DC中的效率,通过小鼠模型研究双重靶向疫苗对免疫应答水平的增强作用。主要研究内容及研究结果有:1.大肠杆菌ghost的制备及鉴定。将裂解质粒pHH43(含E裂解基因盒)转化入大肠杆菌DH5α中,经温控诱导裂解基因—E基因的表达,发现在42℃诱导大约2.5h之后,98.7%的细菌发生裂解,采用离心法获得裂解后的菌体,经激光共聚焦显微镜证实其确为中空大肠杆菌ghost的形态,通过DNA电泳实验证实菌体内不含DNA,提示我们成功制备了大肠杆菌的BG,为下一步实验奠定基础。2.BG装载核酸片段和质粒DNA,并转染巨噬细胞RAW264.7将成功制备的BG与CY5标记的核酸片段按不同浓度混合、孵育,离心收集采用MitoTracker将BG染色后,流式细胞术检测装载效率,发现在最适条件下,95%的BG内均装载了荧光标记的DNA片段。在此基础上装载PI染色的质粒pDSRed-N1,装载效率可达91.98%。将装载有质粒pDSRed-N1的菌蜕转染巨噬细胞RAW264.7,转染48h后采用激光扫描共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞内吞BG的过程及Red基因的转染效率,发现在50-60%转染细胞中可同时观察到绿色荧光信号(即MitoTracker标记的BG)和红色荧光信号(DsRed编码的红色荧光蛋白)。结果提示BG可发挥外源性靶向作用,高效地将质粒DNA导入巨噬细胞(抗原提呈细胞),并获得较高的表达水平。3.FMDV内源性靶向DNA疫苗的构建将FMDV结构蛋白VP1的21-40、141-160和200–213基因片段连接到带有小鼠恒定链(mIi)的真核表达载体pDSRed-mIi中,构建内源性靶向DNA疫苗pDSRed-mIi/FMDV,制备针对各型FMDV均有保护作用的DNA疫苗。包括:以PCR方式从载体pQE31-mIi中获得mIi序列并构建到真核表达载体pDSRed-N1中,并将FMDV病毒的VP1抗原序列分别构建到pDSRed-mIi-N1,经测序鉴定证实我们已经成功地获得含FMDV片段即内源性靶向DNA疫苗。4. VP1抗原的表达和纯化将FMDV病毒的VP1抗原表位中的141-160构建到原核表达载体pGEX-4T-2中,将重组体转化入大肠杆菌BL21中,通过加入IPTG诱导抗原的表达,采用亲和层析的方法纯化目标蛋白,以抗GST抗体为一抗, Western-blotting方法证实我们获得的蛋白为带GST标签的VP1(140-160)短肽,实验结果为后期的FMDV抗体滴度的检测奠定基础。5.细胞转染和动物实验采用BG装载的pDSRed-mIi/FMDV转染RAW264.7细胞,在转染24h后提取总RNA,采用反转录PCR的方法检测FMDV在RAW264.7中的表达水平,发现未装载质粒的BG及裸pDSRed-mIi/FMDV质粒组均未扩增出FMDV基因片段,说明裸质粒难以进入RAW264.7细胞。而BG装载的pDSRed-mIi/FMDV转染组可以扩增出FMDV片段,提示BG是良好DNA疫苗载体,能够使外源FMDV基因片段在巨噬细胞系RAW264.7细胞(抗原提呈细胞)中高效表达。将BG装载的DNA疫苗以肌肉注射法免疫小鼠,每两周免疫一次,共免疫6次。以含GST标签的FMDV141-160为抗原,采用间接ELISA的方法检测小鼠血清中的抗体水平。在6次免疫之后,BG装载的FDMV疫苗的免疫水平明显高于裸质粒注射组。同时,Ii分子能够显著增强抗原提呈能力,进一步增强DNA疫苗的免疫原,表现为Ii-FMDV组的抗体滴度高于FMDV组,BG+Ii-FMDV的抗体滴度高于BG+FMDV组。实验结果显示双重靶向的DNA疫苗的免疫原性优于单靶向疫苗,而单靶向疫苗的效果优于非靶向疫苗。此外我们还检测了在动物实验后小鼠体内抗BG抗体的滴度,发现阴性对照,裸质粒注射组的血清与BG反应的水平很低,而在BG组或装载质粒的BG组中,血清抗体与BG反应的程度很高,当血清稀释80倍时,仍可以使80%左右的BG显示阳性信号,说明在以BG或BG+质粒免疫动物之后,可在体内产生高滴度的抗BG抗体,这些动物有可能对大肠杆菌产生较强的抗性。实验提示,BG在作为载体的同时,其本身还有可能作为疫苗,对相应的疾病产生免疫保护作用。以上结果初步证实,采用BG为载体或将DNA疫苗构建到内源性靶向载体上均可提高疫苗的免疫原性,而采用双重靶向载体技术可进一步提高DNA疫苗的免疫原性水平。采用本方法制备的疫苗还可以是多价的,首先若以BG装载2种或多种DNA疫苗,就对多种疾病产生免疫反应;其次若选取特定的致病性细菌制备BG,那么在使用疫苗之后,就可以在DNA疫苗发生作用的同时对特定的致病性细菌产生免疫保护作用。我们相信,随着双重靶向疫苗制备技术的完善,本研究策略有可能在未来的新型疫苗研究中发挥重要作用。