研究背景 近年来，微量营养素VitA在体内的重要生理代谢产物视黄酸(retinoicacid，RA)多种核受体的发现和鉴定，对研究VitA类物质广泛的生理功能及其作用机制意义重大。在哺乳动物的大脑生长发育过程，视黄酸信号系统在中枢神经系统的神经细胞增殖抑制和终末分化中起关键作用，从而RA亦被认为是一种神经营养素。CNS发育过程中，纹状体内视黄醇结合蛋白、视黄酸结合蛋白、视黄酸核受体(RARs)的特异表达模式和RA的存在，提示RA在出生后及成年哺乳动物纹状体中基因调节的重要作用。研究发现，作为神经系统发育的重要营养因子，RA可以调节神经细胞上神经营养因子受体的表达，并且与NSCs的分化调控有关。因此，该课题研究RA对NSCs增殖和分化的影响，探讨RA定向诱导NSCs分化的作用机制。 RA通过与细胞核内特异受体的结合，调节靶基因表达而发挥其生物学作用，大量的靶基因已被确定，其中某些靶基因就是RARs本身。RARs作为核内受体具有与染色体DNA结合和调控基因表达的功能，当RARs结合了RA而被活化后可对一系列受其调控的靶基因产生“扳机”效应，对RARs的功能分析需要对其进行靶基因的鉴定。有研究指出，神经细胞分化早期的一个变化是细胞周期蛋白表达变化，细胞退出细胞周期。细胞周期调控蛋白不仅调控细胞的分裂增殖，也与细胞分化成熟密切相关，RA可能通过调节细胞周期调控蛋白而影响NSCs的分化。有关RA与受体结合后对相关基因的调控，尤其是对与神经细胞分化有关的基因研究甚少。有研究显示，POU转录因子家族控制CNS干细胞特异基因的表达，nestin和B-FABP基因在CNS的表达依靠POU结合位点，POU蛋白联合激素核受体超家族(包括RARs、RXRs等)可对NSCs进行转录调控。因此，该课题研究NSCs经atRA诱导分化后POU转录因子家族的相关基因变化，希望对了解atRA定向诱导NSCs分化为神经元的分子机制有所帮助。 目的 1.建立体外培养的NSCs细胞模型，为在体外研究NSCs的生长特性及其分化规律提供健康的细胞来源；明确RA对NSCs增殖、分化以及凋亡的影响，筛选RA在定向诱导NSCs分化时的适宜作用剂量和时间。 2.研究NSCs上RARs的表达情况，明确RA诱导NSCs分化过程中，主要通过何种受体途径。 3.研究RA诱导NSCs分化过程中，对细胞周期及相关细胞周期调控因子表达影响，寻找RA在诱导NSCs分化过程中与细胞增殖分化密切相关的靶基因及其调节方式。 4.研究RA在诱导NSCs分化过程，对与NSCs定向分化的相关调控基因表达的影响，探索atRA定向诱导NSCs向神经元方向分化的分子机制。 研究方法 1.通过机械分离法获得新生大鼠纹状体细胞，利用无血清培养液中bFGF的选择培养作用以及连续传代纯化和培养NSCs，为后续实验建立细胞模型。 2.免疫荧光细胞化学染色对分离培养之NSCs及其诱导分化后产生的神经元、星形胶质细胞进行鉴定和细胞分类计数。 3.荧光显微镜、细胞计数、PI染色后FCM技术，分别观察了atRA对NSCs的生长曲线以及诱导NSCs分化后神经元样细胞分化率的影响，检测细胞凋亡率和细胞周期进程的变化。 4.RT-PCR技术检测atRA作用后，NSCs上RARs表达及变化，细胞周期调控因子p53、c-myc基因表达以及POU家族中Brn-4、Brn-3a基因表达的变化； 5.Western-Blotting方法检测atRA对NSCs内影响细胞周期的调控因子c-myc转录后表达水平的影响。 结果 1.通过机械分离并结合选择性培养基等进行新生大鼠纹状体NSCs的分离培养并获得成功，为体外研究NSCs的生长特性及其分化规律提供了一个适宜的细胞模型和健康的细胞来源。 2.不同浓度的atRA对NSCs细胞增殖的影响不同(F=25.632,p=0.000)，atRA浓度为0.01μmol/L时不影响NSCs的生长(P=0.813)，当浓度增加到0.1μmol/L时，即可抑制NSCs的增殖(p=0.042)，并且随着atRA浓度的增加，抑制作用越明显，呈剂量依赖趋势。这种抑制增殖作用主要表现细胞增殖潜伏期延长，对数生长期内细胞倍增延长。atRA诱导NSCs细胞凋亡的作用与atRA剂量有关(F=20.462,p=0.000)，当atRA浓度达到10.0μmol/L时，细胞凋亡率达到13.7％，与对照组相比，差异有统计学意义(p=0.000)。 3.atRA诱导NSCs向神经元方向分化，其作用在一定范围内呈时间、剂量依赖性(F=358.59,p=0.000)，生理浓度(1.0μmol/L)的atRA是诱导NSCs分化的适宜剂量。atRA诱导不同代NSCs分化为NSE阳性神经元样细胞百分率差异无统计学意义(F=1.255,p=0.292)。表明atRA有特异性诱导NSCs向神经元方向分化的作用。 4.利用RT-PCR技术，证实NSCs上存在RARα、RARβ，RARβ基因的表达对atRA存在时间依赖性和剂量依赖性(F=175.984,p=0.000；F=67.930,p=0.000)，生理浓度(1.0μmol/L)的atRA可显著提高RARβmRNA表达水平(P=0.000)。提示atRA可通过调控RARβmRNA水平的途径实现其诱导NSCs分化的作用。 5.细胞周期分析表明，与正常对照组相比，生理浓度(1.0μmol/L)的atRA对NSCs细胞周期有影响，表现为G1期细胞增多(F=36.566,p=0.000)，S期和G2/M期细胞减少(F=35.982,p=0.000)，细胞增殖指数降低(F=36.193,p=0.000)。在atRA诱导NSCs分化过程中，与对照组相比，atRA处理组p53mRNA的表达持续上调(F=10.044，p=0.002)，在第5d达到高峰，同时，atRA处理组c-mycmRNA的表达下调(F=20.891,p=0.000)，且c-myc蛋白表达亦下调(F=43.138,p=0.000)。提示atRA在诱导NSCs分化过程中，可能通过调节细胞周期以及细胞周期调控因子而影响NSCs的增殖分化。 6.bFGF反应性NSCs上Brn-4基因表达水平低，在诱导分化条件下，atRA处理组和对照组Brn-4mRNA表达均增加，但在诱导分化的第1-5d，atRA处理组Brn-4mRNA表达明显较对照组高，差异有统计学意义(p＜0.01)。利用RARs受体拮抗剂阻断atRA的作用后，阻断组Brn-4基因表达较未阻断组低，差异有统计学意义(p=0.000)。在诱导分化条件下，atRA处理组和对照组均可表达Brn-3a基因，但差异无统计学意义(F=0.352,p=0.837)。表明atRA诱导NSCs向神经元分化的作用可能通过上调Brn-4基因的表达，具体路径尚需进一步研究。 结论 1.利用机械分离法进行新生大鼠纹状体NSCs的分离培养并获得成功。RA有抑制NSCs增殖的作用。RA诱导NSCs向神经元方向分化，其作用在一定范围内呈时间、剂量依赖性，诱导剂量以其生理浓度1.0μmol/L较为适宜。 2.RARβ基因的表达对atRA存在时间依赖性和剂量依赖性。atRA可能通过RARβ途径对一系列的靶基因产生“扳机”效应，从而对NSCs诱导分化发挥重要作用。 3.atRA能使NSCs的细胞周期停滞于G0/G1期，atRA可能通过影响细胞周期以及细胞周期的调控因子p53、c-myc转录和转录后水平调控NSCs的增殖分化。 4.RA对NSCs的诱导分化作用发生在NSCs分化早期，atRA诱导NSCs向神经元方向分化与早期上调Brn-4基因表达有关。