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肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌最常见的组织学分类为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中80%以上的肺癌病例属于非小细胞肺癌。非小细胞肺癌又可分为鳞状细胞癌(25-30%),腺癌(35-40%)和大细胞癌(10-15%)。早期非小细胞肺癌治疗主要以手术切除为主,常规化疗是联合应用铂类药物(顺铂、卡铂)与抗代谢药、抗微管药或抗拓扑异构酶药,由于毒副反应以及预后不良,仍不能有效提高患者的5年生存率,近年来药物靶向治疗(主要包括以表皮生长因子受体为靶点的酪氨酸激酶抑制剂或单抗,和以肺癌血管生成为靶点的血管内皮生长因子抑制剂或单抗)以及针对患者自身免疫系统的免疫刺激单抗(免疫检查点阻断剂,包括Ipilimumab,Nivolumab,MK-3475等)在特定人群内取得了可喜进展,引发了人们对肺癌发病机制的深入思考和多方位作用靶点的研究,针对其具体的发病机制探索发展新的治疗方法将有望推进肺癌个体化治疗的进程。乙酰胆碱(ACh)是由神经细胞合成的经典神经递质,通过激活乙酰胆碱受体(ACh R)的两个家族成员——毒蕈碱型(m ACh R)和烟碱型(n ACh R)胆碱受体发挥作用。越来越多的研究表明,除神经细胞外,多种肿瘤细胞均可合成和分泌乙酰胆碱作为一种生长因子,参与细胞的生长增殖,抵抗凋亡,血管发生,转移侵袭,促进癌症的进程。这种非神经元胆碱能系统极有可能是调控肿瘤发展进程的另一个重要的信号系统。许多实验室的工作表明,在恶性肿瘤表达的多种m ACh R亚型中,与正常组织相比M3受体表达显著上调,且与肿瘤的预后不良相关。有研究表明,M3受体选择性拮抗剂能够抑制小细胞肺癌细胞增殖并降低裸鼠移植瘤MAPK磷酸化水平,为肺癌的预防和治疗提供了新的药物研发策略。有研究报道,在正常角质化细胞、黑色素瘤细胞、M受体转染的CHO细胞及SCLC细胞上,激活M1或M3受体可改变细胞黏附分子的活性,可能与肿瘤的转移与浸润相关。因此有关M3受体的研究受到极大关注,成为相关研究领域的热点。本研究的重点是观察M3受体拮抗剂对2种NSCLC细胞生长增殖、运动和迁移中的影响,并探索M3受体参与非小细胞肺癌发展进程的信号通路和关键分子,预期研究结果将有助于确认M3受体是否可作为抗肿瘤靶标,将为确立胆碱能受体系统在肿瘤生长调控中的地位提供实验依据。实验方法如下:(1)以CCK-8法测定M3受体拮抗剂、激动剂以及PKC抑制剂对体外培养的NSCLC细胞增殖的影响。(2)应用激光共聚焦显微镜监测激动剂单独给药以及拮抗剂和激动剂伴随给药NSCLC细胞内游离钙离子的动态变化。(3)伤口愈合实验检测M3受体拮抗剂对NSCLC细胞迁移能力的影响。(4)Transwell侵袭实验检测M3受体拮抗剂对NSCLC细胞侵袭能力的影响。(5)利用脂质体介导的si RNA转染技术敲减M3受体并检测敲减M3受体后对NSCLC细胞生长活力的影响。(6)以Western蛋白印迹法检测M3受体拮抗剂对NSCLC细胞增殖信号通路(Akt、MAPK)、细胞周期调节蛋白(cyclin D1、CDK4、p21)以及迁移相关分子(MMP-2)蛋白表达水平的影响。实验结果如下:(1)本研究首先观察M3受体拮抗剂在(1.25μM~80μM)剂量范围内对NSCLC细胞生长增殖的影响,实验结果显示,R2-8018与达非那新体外能够浓度依赖性地抑制H1299细胞和H460细胞的增殖,其中R2-8018抑制H1299细胞增殖的效果更明显,作用48 h的IC50值为10.6μmol/L。(2)外源性补充激动剂卡巴胆碱和氯化乙酰胆碱无法促进H1299细胞和H460细胞增殖。(3)转染M3 si RNA 72 h之后检测检测敲减效率,western蛋白印迹法结果显示,转染M3 si RNA显著降低M3受体的表达(p<0.01);CCK-8法48 h和72 h检测结果显示,敲减M3受体,H1299细胞增殖明显被抑制,并且随si RNA作用时间延长,抑制作用更显著(48 h:p<0.5,72 h:p<0.01)。结果说明,敲减M3受体能够抑制H1299细胞增殖。(4)激光共聚焦显微镜监测细胞内钙离子的动态变化,30μM的卡巴胆碱能够引起H1299细胞钙信号增强,而给予拮抗剂达非那新预处理30 min的H1299细胞30μM卡巴胆碱则观察不到钙信号的增强,达非那新能够完全阻断卡巴胆碱引起的细胞钙信号增强。(5)蛋白激酶C抑制剂Staurosporine体外对H1299细胞存活具有明显的抑制作用,并且R2-8018可浓度依赖性地降低H1299细胞PKC-α蛋白表达(10μM:p<0.01,20μM:p<0.01)。(6)R2-8018作用H1299细胞24 h,可显著抑制H1299细胞的迁移和侵袭能力,并浓度依赖性地下调基质金属蛋白酶MMP-2蛋白表达水平。(7)达非那新下调H1299细胞Akt、GSK3β和cyclin D1蛋白表达水平。(8)R2-8018上调H1299细胞p21蛋白表达水平。结论:应用M3受体拮抗剂或敲减M3受体能够体外抑制非小细胞肺癌细胞增殖,作为一种G蛋白偶联受体,拮抗M3受体我们可以观察到H1299细胞钙离子释放受到抑制以及蛋白激酶C活性降低,说明拮抗M3受体可能通过其经典的G蛋白偶联信号发挥细胞生长抑制作用;M3受体拮抗剂能降低NSCLC细胞Akt、GSK3β、cyclin D1、CDK4蛋白表达,增加p21蛋白表达,其涉及机制可能为拮抗M3受体可以通过抑制Akt磷酸化,减轻其对下游GSK3β磷酸化,进而增强GSK3β活性,促进对cyclin D1的降解,抑制cyclin D1-CDK4复合物的形成,并且上调p21表达,使细胞无法顺利进入S期而发生G0/G1期阻滞,最终导致细胞增殖受到抑制,此外,M3受体拮抗剂还可能通过抑制MAPK信号通路的激活而产生抑制细胞增殖的作用;M3受体拮抗剂下调基质金属蛋白酶MMP-2蛋白表达,抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。