近年来单克隆抗体药物发展迅速,已成为全球新药开发的热点。单抗在临床上主要用于肿瘤、自身免疫性疾病及炎症疾病的治疗。单抗的分子量、体积和极性都远大于小分子,使得单抗与小分子药物在药代动力学特征上具有非常大的差异。肠外给药、分布容积小、消除半衰期长是单抗最显著的临床药代动力学特征。一直以来,蛋白类药物生物分析的首选方法是配体结合分析（LBA）,但由于LBA的局限性,近年有研究者提出了LC-MS/MS的补充/替代分析策略。本课题分别建立了LC-MS/MS法对血清中的两种单抗（SHR-1603和SHR-1222）进行定量检测,经验证的LC-MS/MS方法都分别应用于两种药物的临床前研究,并与两种单抗药物的电化学发光法（MSD-ECL,基于LBA的分析方法）进行比较。1.电化学发光法测定食蟹猴和大鼠血清中SHR-1603SHR-1603是由江苏恒瑞医药股份有限公司研发的全人源化单抗,作用靶点为CD47,目前处于临床I期,临床拟用于肿瘤治疗。首先建立了MSD-ECL法分别检测食蟹猴和大鼠血清中的SHR-1603。该方法的定量范围为19.5¹0000ng/mL,允许血清样品进行25600倍内的稀释。该方法符合生物样品测定要求,可以用于食蟹猴和大鼠血清中SHR-1603浓度的测定。2.两种LC-MS/MS法测定食蟹猴和大鼠血清中的SHR-1603建立了两种具有不同预处理方式的LC-MS/MS方法,直接沉淀LC-MS/MS法（straight LC-MS/MS）和亲和富集LC-MS/MS法（IA-LC-MS/MS）,用于测定食蟹猴和大鼠血清中SHR-1603的浓度。LC-MS/MS定量蛋白类药物的基本流程包括:样品的纯化或富集,目标蛋白的酶解,最后对选定的特征性肽段或称作替代肽段进行检测,完成蛋白的定量。直接沉淀LC-MS/MS法是指:直接将血清样品中的蛋白都沉淀下来,然后进行蛋白酶解,酶切结束后的多肽混合物进入质谱检测。亲和富集LC-MS/MS法是指:在酶解之前对样品进行亲和纯化和富集,磁珠上包被抗原CD47,将样品中的SHR-1603捕获下来,然后进行蛋白酶解,酶切结束后的多肽混合物进入质谱检测。LC-MS/MS法方法开发的关键点是为SHR-1603的定量选择合适的替代肽段,需要对肽段的灵敏度、特异性、稳定性等方面进行考察。这部分工作与军事医学科学院的段小涛研究员合作,所使用的仪器系统是Nano LC-LTQ/Orbitrap。Mascot软件进行蛋白搜库与肽段归属,获得所有肽段的序列信息、带电荷状态、可产生的子离子等信息。通过pBLAST工具,在Rattus、Macaca fascicularis和Homo sapians Swiss Prot蛋白数据库中进行搜索,筛选出独特的肽段。候选肽段的液质条件的优化在Agilent 6495 QQQ上进行。根据灵敏度、特异性和稳定性等方面的考察结果,最终选择SHR-1603轻链上的肽段LLIYSGSTLQSGVPSR用于定量。对酶解条件进行了优化,出于通量的考虑和操作的简易性,最终确定了DTT+IAA+60°C震荡孵育1.5 h的酶解方式。为了解决疏水性多肽LLIYSGSTLQSGVPSR的表面吸附,对多种防吸附方式进行考察,最后选择了BSA digest作为防吸附试剂,有效的解决了表面吸附问题。适当增加溶剂中有机相的比例（20%）,有利于提高肽段的溶解度。两种LC-MS/MS方法都经过了验证。食蟹猴和大鼠血清中,直接沉淀法LC-MS/MS在250⁵00000 ng/mL的浓度范围内线性良好;亲和富集法LC-MS/MS在100¹00000 ng/mL的浓度范围内线性良好。两种LC-MS/MS方法的精密度和准确度,均满足要求。两种LC-MS/MS方法以及MSD-ECL法,都分别应用于SHR-1603注射液在大鼠和食蟹猴中的药动学试验,并将测得值进行比较和交叉验证。比较的结果显示:低剂量组中,3种方法的测量结果一致,没有显著性差异（P>0.05）,两种LC-MS/MS方法得到的药物浓度与MSD-ECL方法得到相应的浓度的比值在1.05到1.11之间;中、高剂量组中,LC-MS/MS法测得的药物浓度高于MSD-ECL法测得的相应的浓度,三种方法的检测结果有显著性差异（P<0.05）。直接沉淀LC-MS/MS法在大鼠血清中测得的药物暴露量最高,亲和富集LC-MS/MS则在食蟹猴中测得的药物暴露量最高,存在种属差异。交叉验证的结果同样表明,LC-MS/MS法测得的值普遍高于MSD-ECL法,两种LC-MS/MS法在不同种属内的检测值也存在差异。这可能是因为MSD-ECL法检测的是游离单抗,而LC-MS/MS法测得的是总单抗（游离和非游离）。至于大鼠与食蟹猴中的种属差异,可能是由于动物免疫系统的之间的巨大差异引起。对两种分析技术进行比较,LC-MS/MS方法的动态定量范围优于MSD-ECL法。MSD-ECL的定量范围19.3¹0000 ng/mL（500倍）;亲和富集LC-MS/MS的定量范围100¹00000 ng/mL（2000倍）;直接沉淀LC-MS/MS法的定量范围250⁵00000 ng/mL（1000倍）。SHR-1603在大鼠和食蟹猴的血清浓度C_max可以达到1² mg/mL,因此LC-MS/MS法的定量范围更具有优势。LC-MS/MS法的灵敏度低于MSD-ECL法。这主要是由于血清基质中高丰度蛋白提高了噪音背景,肽段带多个电荷使质谱信号被分散,灵敏度下降。亲和富集LC-MS/MS法由于经过了样品的纯化与富集,灵敏度优于直接沉淀LC-MS/MS法。虽然LC-MS/MS的灵敏度比MSD-ECL低,但完全可以满足药动学的检测要求。LC-MS/MS法对试剂依赖性低,不需要特异性抗体,可以提供更为快速的方法开发。使用单抗SHR-1603（而不是替代肽段）建立标准曲线,同位素标记的肽段作为内标,LC-MS/MS法的检测准确性更高。LC-MS/MS法的前处理比MSD-ECL法简单,其中又以直接沉淀LC-MS/MS法最为简便,因此分析通量更高,可以满足临床前和临床中大量样本的检测需求。与MSD-ECL法相比,LC-MS/MS法更具成本效益和分析效率。3.LC-MS/MS法测定食蟹猴血清中的SHR-1222SHR-1222是由江苏恒瑞医药股份有限公司研发,靶向硬骨素的全人源化单抗,目前处于临床I期,临床拟用于治疗骨质疏松。建立LC-MS/MS法检测食蟹猴血清中的SHR-1222,考察SHR-1222注射液的毒代动力学。与之前研究中建立的MSD-ECL方法进行比较,对高浓度抗药抗体（ADA）改变SHR-1222药时曲线的原因进行探索。为SHR-1222的定量选择合适的替代肽段,对肽段的灵敏度、特异性、稳定性等方面进行了考察。这部分工作与中国科学院上海药物所的谭敏佳研究员合作,所使用的仪器系统是Nano LC-Orbitrap Fusion。使用Mascot软件进行蛋白搜库,使用pBLAST工具将同源肽段排除。候选肽段的液质条件的优化在Agilent 6495QQQ上进行,引入了Skyline软件优化质谱参数,与Agilent Mass Hunter数据采集软件联用,提高了效率。最终选择SHR-1222轻链上的肽段LLIYYTSNR用于定量。经验证,食蟹猴血清中LC-MS/MS法在2.00⁵00μg/mL的浓度范围内线性良好,质控样品精密度和准确度均满足要求。经过验证的LC-MS/MS法应用于SHR-1222（60 mg/kg中剂量组）在食蟹猴中的毒代动力学试验。与之前研究中建立的MSD-ECL法相比,LC-MS/MS法测得的SHR-1222浓度与MSD-ECL法测得的SHR-1222浓度基本一致,C_max和AUC的比值分别在0.89⁰.95和0.80¹.00之间。LC-MS/MS法定量范围优于MSD-ECL法,可以提供更为快速的方法开发,更具成本效率和效率。使用单抗SHR-1222（而不是替代肽段）建立标准曲线,同位素标记的肽段作为内标,提高了检测准确度。前处理比MSD-ECL法简单,分析通量高。MSD-ECL法的检测结果显示:在60 mg/kg SHR-1222的毒代试验中,2只食蟹猴的个别血清样本检测值异常低。调查发现,这3个异常血清样本中,抗SHR-1222的ADA浓度水平都很高,滴度≥16。而其它血清样品中,ADA滴度≈2。说明高浓度的ADA可以改变单抗药物的动力学曲线。然而,LBA方法检测的准确度容易受到ADA的干扰,当用LBA法观察到药物暴露减少时,可能很难区分是ADA干扰了MSD-ECL法对SHR-1222的检测,还是ADA介导的药物体内清除加快。本研究中建立的LC-MS/MS法可以克服ADA的干扰,测定的是血清样品中药物的总浓度。LC-MS/MS检测结果显示,SHR-1222在3个异常血清样本中的检测值也明显低于同组中的其他动物。因此可以确定高浓度水平的ADA可以加速SHR-1222在食蟹猴体内的清除,表现为药物暴露量降低,而不是由于ADA干扰了检测。SHR-1222靶向的硬骨素是一种可溶性的游离靶点。针对可溶性靶点的拮抗性单抗药物,受血清中ADA（以及游离靶点）的影响,一般不会产生长期积累的生物活性。LC-MS/MS与MSD-ECL法对SHR-1222的定量检测结果一致,符合该类型药物的特点。4.结论本课题建立了LC-MS/MS方法定量检测食蟹猴和大鼠血清中的单抗SHR-1603,建立了LC-MS/MS法定量检测食蟹猴血清中的单抗SHR-1222,并分别与这两种单抗药物的MSD-ECL法进行了全面比较。由于LC-MS/MS法检测的是总抗体浓度,MSD-ECL法测的是游离单抗,LC-MS/MS的检测值普遍高于MSD-ECL法。LC-MS/MS方法在快速的方法开发、定量范围、准确性等方面具有优势,显示出更高的成本效益和效率。LC-MS/MS法为单抗药物的临床前和临床评价研究提供了一种很有前途的补充或替代分析策略,是推动单抗药物的研究开发的有力工具。