研究背景:血栓形成是心脑血管疾病发生和发展的重要病理机制,而血小板在血栓形成过程中起着关键作用。血小板通过血小板膜糖蛋白实现粘附、聚集和活化反应等功能。已知血小板P-选择素(CD62p)和糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)在血小板膜上的表达量的增加可以作为血小板活化的特异性指标。在一些血栓性疾病中,如心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病中,血小板常呈现活化状态。测定血小板膜糖蛋白表达水平可以了解血小板的活化状态。目前,常用电泳法、放免法和流式细胞术等检测血小板膜糖蛋白,但均有不足之处。本研究采用抗血小板膜糖蛋白的单克隆抗体包板,以生物素-亲和素-酶联免疫反应(BA-ELISA)测定血小板膜糖蛋白功能。该方法的建立将填补国内BA-ELISA方法检测血小板膜糖蛋白功能的空白,易于在临床推广应用,将具有较大的经济和社会效益。目的:(1)应用单克隆抗体和生物素-亲和素系统建立生物素-亲和素-酶联免疫分析方法,并对其灵敏度、批内和批间差异等方法学考核。(2)该方法应用于临床标本(急性心肌梗死、急性脑梗死和糖尿病患者等)检测并评价临床实用价值。方法:应用抗血小板CD62p单抗SZ51和抗血小板GPIIb/IIIa单抗7E3分别包板,加入经ADP诱导的或未诱导的正常人富含血小板血浆(PRP),以生物素标记的抗GPIb单抗SZ2(Biotin-SZ2)反应后,加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(Avdin-HRP)检测,邻苯二胺(OPD)显色后,酶标仪读取吸光度值(OD)。对其灵敏度,批内、批间差异作方法学评估,并应用该方法对抑制性单抗SZ21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果测定,并与流式细胞术(FCM)进行比较。应用该方法分析急性心肌梗死患者(AMI)、急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)患者、糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者及正常人的血小板膜上的CD62p和GPIIb/IIIa的水平,并与流式细胞术(FCM)作比较。结果:(1)灵敏度:该方法可检测血小板计数低达6.25×109/L(SZ51包被板)和3.13×109/L (7E3包被板)的标本。(2)重复性:该方法测定血小板膜的CD62p OD值的批内差异和批间差异分别为4.38%和6.23%(n=10);GPIIb/IIIa的OD值的批内差异和批间差异分别为5.78%和6.96%(n=10)。(3)方法学比较:本法和流式细胞仪同时测定正常人和患者的CD62p和GPIIb/IIIa水平。结果经直线回归分析得r=0.86,可见两方法有较好的相关性。(4)血小板聚集抑制实验:设SZ21抑制组、阿司匹林抑制组和对照组。BA-ELISA实验结果显示,在体外ADP诱导的血小板聚集实验中,SZ21和阿司匹林可明显抑制血小板的活化,且其抑制作用呈剂量依赖性。(5)临床应用:应用本法测定30例AMI、30例ACI、30例DM患者和50例正常人的ADP诱导的(未诱导的)血小板的CD62p和GPIIb/IIIa的OD值。其分别为1.76? 0.56(0.72?0.25),1.95?0.53(1.53?0.61);1.51?0.14(0.61?0.16),1.88?0.42(1.46?0.57)和1.38?0.26(0.43?0.21),1.61?0.42(1.23?0.32),显著高于正常人0.68?0.21(0.18?0.09)和0.87?0.29(0.44?0.14)(P<0.01)。同时与FCM方法检测血小板膜表面CD62p和GPIIb/IIIa表达情况作比较,结果一致。结论:(1)首先在国内建立了人血小板膜糖蛋白功能测定的BA-ELISA检测方法。(2)该方法敏感性好、特异性高、重复性好。(3)该方法可以测定血小板功能活化剂或抑制剂对血小板功能影响,有助于抗血小板药物筛选、临床用药指导和药物监测;可以测定血栓性疾病或血栓形成相关性疾病引起的血小板活化程度,有助于反映血栓性疾病的病理状态,具有较高的临床使用价值。(4)在AMI、ACI和DM患者体内存在血小板膜糖蛋白CD62p和GPIIb/IIIa的高表达;联合检测CD62p和GPIIb/IIIa的表达量可以更好的判断血小板的活化状态,为临床预防、诊治和血栓形成性疾病的预后提供依据。