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目的:登革病毒(Dengue virus,DENV)包膜蛋白第Ⅲ结构域(Envelope domainⅢ,EDⅢ)介导病毒吸附感染受体细胞,并刺激机体产生针对DENV的型特异性抗体。二次异型DENV感染时,由于抗体依赖感染增强作用(Antibody dependent enhancement,ADE),体内存在的登革病毒抗体会导致感染增强并诱发重症登革热(Severe dengue fever,SD)。通过检测登革热(Dengue fever,DF)患者体内已存在的抗体型别,结合本次感染的病毒型别,判断是否发生二次异型感染,可用于评估患者发展为重症登革热的风险。目前,登革病毒血清抗体分型可以通过蚀斑减少中和实验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)实现,但由于PRNT技术操作繁杂且耗时,主要局限在科研中应用。因此临床急需建立一种能简单、快速对登革病毒血清型特异性抗体分型的新技术。本研究拟通过原核基因工程技术获得登革病毒EDⅢ重组蛋白,建立ELISA检测方法对登革病毒血清特异性抗体分型,并初步评价该方法的诊断效果。为今后应用于临床DF患者病情的评估,预测重症登革热的发病风险以及对登革热流行地区进行流行病学调查提供技术支撑。方法:1.利用PCR技术分别扩增登革1型和2型病毒EDⅢ基因,构建原核基因表达载体pET28b-EDⅢ,转化BL21后经IPTG诱导表达,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定重组蛋白,采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白。2.利用高碘酸钠法对登革1型和2型病毒EDⅢ重组蛋白进行辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记,经凝胶过滤层析纯化酶标记蛋白。3.建立登革1型和2型病毒血清抗体分型检测的双抗原夹心ELISA法,对抗原包被浓度、酶标抗原浓度、标本稀释度以及显色时间等条件进行优化。4.利用自建的分型ELISA法检测登革热患者恢复期血清标本,与登革病毒IgG抗体检测试剂盒和PRNT方法的检测结果进行比较,评估登革1型和2型病毒血清抗体分型ELISA方法检测性能。成果:1.成功诱导表达登革1型和2型病毒EDⅢ重组蛋白,两种重组蛋白均主要以包涵体蛋白形式表达;MALDI-TOF-MS鉴定结果显示两种重组蛋白分别是登革1型和2型病毒EDⅢ蛋白;采用镍亲和层析技术获得高纯度的重组蛋白。2.利用高碘酸钠法获得酶标记蛋白EDⅢ-HRP,并通过凝胶过滤层析法成功纯化了酶标记蛋白EDⅢ-HRP。3.建立了登革1型和2型病毒血清抗体分型检测的双抗原夹心ELISA法,方法条件优化结果显示最佳抗原包被浓度和酶标抗原浓度均为1μg/mL,血清最佳稀释度为1:40,最佳显色时间为20min。4.48例登革1型病毒感染患者恢复期血清标本,登革病毒IgG ELISA检测试剂盒和自建1型IgG ELISA检测阳性率均为83.3%(40/48),低于PRNT的阳性率(95.8%);自建1型IgG ELISA和PRNT之间存在相关性,相关系数R2为0.4590,P<0.01。11例登革2型病毒感染患者恢复期血清标本,自建2型IgG ELISA检测的阳性率为81.8%(9/11),高于登革病毒IgG检测ELISA试剂盒阳性率(45.5%)。自建1型IgG ELISA和2型病毒感染患者血清之间的交叉反应为22.9%(11/48),自建2型IgG ELISA和1型病毒感染患者血清之间的交叉反应为45.5%(5/11),总交叉反应为27.2%(16/59)。结论:成功建立了 DENV1和DENV2血清抗体分型ELISA检测方法,对登革热患者血清中的分型抗体的检测均具有高度的敏感性,有可能成为DF血清抗体分型诊断和血清流行病学调查的有效工具,为登革病毒血清抗体分型的临床应用奠定基础。