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研究背景及目的:基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的一员,它不仅参与胚胎着床、胎儿心脏发育、血管新生、伤口愈合等生理过程,还参与炎症、肿瘤转移等病理过程。MMP-9在心血管系统中分布广泛,既往研究发现在多种心血管疾病中可见其明显增高,且与心血管疾病的心室重构程度呈正相关,MMP-9基因敲除或降低MMP-9蛋白表达可减轻心血管重构及延缓心血管疾病的发展,提示MMP-9的增高可能具有促进心室重构的发生发展作用,但其具体机制尚未完全明确。MMP-9对血压升高作用既往的研究不多。前期我们的研究发现注射外源性MMP-9后,不仅可成功构建大鼠心室重构模型,且可升高模型鼠的血压。进一步研究发现这些模型鼠伴有ACE、AngI、AngII水平的升高,使用奥美沙坦阻断血管紧张素II 1型受体(AT1)后,可使MMP-9引起的心室重构改善和血压降低,提示MMP-9促心室重构和升高血压作用可能部分与肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)激活有关,但MMP-9有无独立于RAAS(即AngII-Agtr1通路激活)而致血压升高及致心室重构作用尚不清楚。业已证明,AngII主要通过与AT1结合而起到升高血压及致心室重构作用。AT1在啮齿类动物中有三种亚型:血管紧张素Ⅱ1A型受体(Agtr1a)、血管紧张素Ⅱ1B型受体(Agtr1b)和血管紧张素Ⅱ1C型受体(Agtr1c),Agtr1a相当于人类的AT1的作用,是啮齿类动物AngII升高血压及心室重构等病理作用的通路蛋白。Agtr1a基因敲除,将阻断RAAS的升高血压和致心室重构作用。本研究拟利用Agtr1a基因敲除鼠模型,通过注射外源性MMP-9和腺相关病毒(AAV9)为载体致内源性MMP-9高表达的方法,探讨MMP-9是否可独立于AngⅡ-Agtr1通路导致血压升高及心室重构。为高血压及心室重构的发病机制提供新的认识,为治疗高血压及心室重构预防及治疗靶点提供理论支持。方法:1、实验动物:Agtr1a(-/-)雄鼠与Agtr1a(+/+)雌鼠两者繁育得到Agtr1a(+/-),随后使用同代Agtr1a(+/-)雌雄共同繁育,通过基因型鉴定,得到Agtr1a(+/+)、Agtr1a(-/-),采用F5代的8周龄的Agtr1a(+/+)、Agtr1a(-/-)用于尾静脉注射外源性重组小鼠MMP-9蛋白。F6代的8周龄的Agtr1a(+/+)、Agtr1a(-/-)用于AAV9内源性过表达MMP-9蛋白。内源性高表达MMP-9使用构建cTNT启动心肌细胞特异性过表达MMP-9腺相关病毒(AAV9)的方法实现,每组均雌雄各半。2、动物分组及处理:(1).外源性MMP-9蛋白输注组:按Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)分别按小鼠体重及雌雄分层随机分为Agtr1a(+/+)对照组(下文称WT control组)、Agtr1a(+/+)低剂量组(下文称WT 5μg/Kg组)、Agtr1a(+/+)高剂量组(下文称WT 10μg/Kg组),Agtr1a(-/-)对照组(下文称KO control组)、Agtr1a(-/-)低剂量组(以下称KO 5μg/Kg组)、Agtr1a(-/-)高剂量组(下文称KO 10μg/Kg组),6只/组,WT control组及KO control尾静脉注射生理盐水200μl,WT 5μg/kg及KO 5μg/kg尾静脉注射重组小鼠MMP-9蛋白5μg/kg+生理盐水共200μl,WT 10μg/kg及KO 10μg/k组尾静脉注射MMP-9蛋白10μg/kg+生理盐水共200μl,biw(每周一、周四)。(2).内源性MMP-9蛋白过表达组:Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)小鼠均按体重及雌雄分层随机分为Agtr1a(+/+)AAV9空载对照组(以下称WT AAV9 control),Agtr1a(+/+)AAV9-MMP-9过表达组(以下称WT AAV9-MMP-9组),Agtr1a(-/-)AAV9空载对照组(以下称KO AAV9 control组),Agtr1a(-/-)AAV9-MMP-9过表达组(以下称KO AAV9-MMP-9组),6只/组,WT AAV9 control以及KO AAV9 control组尾静脉注射AAV9空载病毒100μl,WT AAV9-MMP-9组、KO AAV9-MMP-9组尾静脉注射AAV9-MMP-9 100μl。3、观察项目:外源性MMP-9蛋白输注组及内源性MMP-9蛋白过表达组观察及检测项目如下:监测体重变化,每组小鼠初始血压,第八周末测定血压值;通过心脏超声测量左室舒张末期前壁厚度(LVAW d)、左室收缩末期前壁厚度(LVAW s)、左室舒张末期后壁厚度(LVPW d)、左室收缩末期后壁厚度(LVPW s)、左室舒张末期内径(LVID d)、左室收缩末期内径(LVID s)、左室重量(LV mass)、射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、左室舒张早期快速充盈的充盈峰E峰/舒张晚期(心房收缩)充盈的充盈峰A峰(E/A值)、左室舒张末期容积(LV vol d)、左室收缩末期容积(LV vol s);麻醉后眼球取血,取左心室,计算左室重量指数(LWVI)=左心室重量/小鼠体重;心肌病理切片HE、Masson、天狼猩红染色判断心肌细胞形态、结构、心肌胶原的变化;通过心肌MMP-9免疫荧光染色观察心肌内MMP-9蛋白定位、定量;腹主动脉及肠系膜动脉HE、Masson观察血管形态及胶原容积分数;ELISA测定血中MMP-9、TIMP-1、ACE、AngⅡ、ACE2、Ang(1-7)、ET-1、eNOS含量,Western blot测定心肌中MMP-9、TIMP-1蛋白含量,Real Time-PCR测得心肌中MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA。结果:1、输入或高表达MMP-9对Agtr1a基因敲除小鼠血压的影响(1)基线情况外源性MMP-9输入组及内源性高表达MMP-9组,实验过程中,小鼠存活率均为100%;小鼠初始平均体重水平在各组之间均无明显差异;Agtr1a(-/-)鼠初始血压(收缩压、舒张压、平均动脉压)均低于Agtr1a(+/+)鼠(p<0.001),而Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)鼠各自组间初始血压无明显差异(p>0.05)。(2)第八周末血压(1)外源性MMP-9输入后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组的收缩压、舒张压、平均动脉压明显升高,且呈剂量依赖性(p<0.05)。心率无明显差异(p>0.05);(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组的收缩压、舒张压、平均动脉压明显升高(p<0.05),心率无明显差异(p>0.05)。2、输入或高表达MMP-9对Agtr1a基因敲除小鼠血管的影响(1)肠系膜动脉腔壁比(1)外源性MMP-9输入组,Agtr1a(+/+)组肠系膜动脉腔壁比明显减少(p<0.05),Agtr1a(-/-)组肠系膜动脉腔壁比有减少趋势。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组肠系膜动脉腔壁比明显减少(p<0.05)。(2)腹主动脉病理改变:(1)外源性MMP-9输入后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组,腹主动脉胶原容积分数明显降低(p<0.05),腹主动脉腔壁比无明显变化。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组,腹主动脉胶原容积分数明显降低(p<0.05),腹主动脉腔壁比无明显变化。3、输入或高表达MMP-9对Agtr1a基因敲除小鼠心室重构的影响(1)心脏超声改变(1)外源性MMP-9输注后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组可见心室壁肥厚,每搏输出量、心脏收缩功能及舒张功能在各组之间无明显差异(p>0.05)。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组可见心室壁肥厚,除Agtr1a(+/+)组每搏输出量明显增加外(p<0.05),心脏收缩功能及舒张功能在各组之间无明显差异(p>0.05)。(2)左室重量指数变化(1)外源性MMP-9输入后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)左室重量指数(LVWI)明显增大。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组中左室重量指数(LVWI)增大。(3)心肌组织改变(HE染色)(1)外源性MMP-9输注后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌细胞增大,心肌细胞排列紊乱,部分心肌纤维断裂,胞浆溶解坏死,心肌细胞之间边界模糊。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌细胞增大,心肌细胞排列紊乱,部分心肌纤维断裂,胞浆溶解坏死,心肌细胞之间边界模糊。(4)心肌胶原容积分数变化(1)外源性MMP-9输入组,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌胶原容积分数明显减少(p<0.05)。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌胶原容积分数明显减少(p<0.05)。(5)心肌I型胶原、III型胶原改变(天狼猩红染色)外源性MMP-9输注及内源性高表达MMP-9组,心肌天狼猩红染色I型胶原、III型胶原、I/III型胶原均无明显差异(p>0.05)。4、输入或高表达MMP-9对Agtr1a基因敲除鼠血浆MMP-9、TIMP-1、AngⅡ、ACE2、Ang(1-7)、内皮素-1(ET-1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平的影响(1)输入外源性MMP-9后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组中,血浆中MMP-9、MMP-9/TIMP-1、AngⅡ均明显升高,ACE2、Ang(1-7)明显下降(p<0.05);Agtr1a(-/-)组中尚有ET-1明显下降、eNOS明显上升(p<0.05)。(2)内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)及Agtr1a(-/-)组中,血浆中MMP-9、MMP-9/TIMP-1均明显升高,Ang(1-7)均明显下降;AngⅡ在Agtr1a(+/+)组中明显升高,ET-1在Agtr1a(-/-)组中明显下降(p<0.05)。5、输入或高表达MMP-9对Agtr1a基因敲除鼠心室肌MMP-9表达的影响(1)心肌MMP-9蛋白分布(免疫荧光染色)外源性MMP-9输注及内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌免疫荧光染色中MMP-9蛋白明显增多,尤其在肌纤维紊乱及断裂处分布较多。(2)心肌MMP-9、TIMP-1蛋白量改变(Western blot)外源性MMP-9输注及内源性高表达MMP-9后,Agtr1a(+/+)组及Agtr1a(-/-)组心肌MMP-9、MMP-9/TIMP-1均明显增高。(p<0.05)(3)心肌中MMP-9 mRNA及TIMP1mRNA改变(Real Time PCR)(1)外源性MMP-9蛋白输注后,Agtr1a(+/+)组心肌中MMP-9 mRNA、MMP-9/TIMP1 mRNA有上升趋势;Agtr1a(-/-)组心肌中MMP-9 mRNA、MMP-9/TIMP1 mRNA明显上升。(p<0.05)(2)内源性高表达MMP-9蛋白后,Agtr1a(+/+)组、Agtr1a(-/-)组心肌中MMP-9 mRNA、MMP-9/TIMP1mRNA均明显上升。(p<0.05)结论:MMP-9可以使Agtr1a基因敲除小鼠血压升高及发生心室重构,这提示MMP-9可能存在独立于RAAS(即AngⅡ-Agtr1通路激活)而致血压升高及致心室重构作用。