论文部分内容阅读
甲状腺素(thyroid hormone,TH)是一类氨基酸衍生物,在个体发育、维持内环境稳定、细胞增殖和分化等方面均有广泛的作用。牙鲆(Paralichthys olivaceus)在我国是一种重要的海洋经济养殖鱼类,其从仔鱼到稚鱼的转变中经历一个剧烈的变态发育过程,伴随着身体对称性的失去和眼睛的移位等等,该过程受甲状腺素的调控。业已证实,甲状腺素通过甲状腺素受体(thyroid hormone receptor,TR)诱导加速牙鲆仔鱼的变态。但到目前为止,关于甲状腺素调控仔鱼变态的机制知之甚少。本文从三个方面展开研究,主要结果如下:1、牙鲆变态过程中甲状腺素受体和脱碘酶表达的关系为研究外源性TH对牙鲆变态期间脱碘酶和甲状腺素受体的影响,笔者将15 dph(15 days post hatch,出膜后15天)的仔鱼随机分成3组:正常对照组(normal control,NC)、TH处理组和TU(thiourea,硫脲)处理组,饲养直至41 dph。为了评估用TU处理的牙鲆是否可以通过外源性TH来拯救其变态,笔者在35 dph(NC组牙鲆已经完成变态)时设计了拯救实验,将TU组的幼体分成3组:TU组继续在含硫脲的海水中饲养,TU+NC组转入天然海水中饲养,TU+TH组转入含有外源性甲状腺素的海水中饲养。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测了3个甲状腺素受体TRαA、TRαB、TRβ和3个脱碘酶(deiodinases,Ds)D1、D2、D3基因m RNA在各实验组各时期的表达情况,利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测了各实验组各时期牙鲆幼体体内甲状腺素T4和T3的总体水平。结果显示:随着牙鲆幼体开始进入变态进程(16-21dph),D1、D2、TRαA、TRαB和TRβ的表达开始增加,体内甲状腺素水平亦如此;本试验中除去D3以外其他所有分析的对象,均在变态高峰期(25-31 dph)出现峰值水平,此后表达水平全部以相似的趋势下降直到变态结束(35-41 dph)。不同的是,变态后TRβ转录水平仍然很高。D3表现出不规则的波浪状表达变化趋势,这与变态过程中分析的其他对象不同。外源TH处理显著促进了牙鲆幼体的变态。ELISA实验结果显示,外源TH处理在变态早期增加了牙鲆体内的TH水平,但在之后没有明显效果。q RT-PCR显示D1的表达在整个变态过程中被外源TH处理下调。D2、TRαA和TRαB在变态早期被TH处理上调,随后被下调。在变态早期和高峰期,TH处理上调了D3和TRβ的表达。与TH处理相反,TU处理抑制了牙鲆幼体的变态。本研究结果表明,TU处理在整个变态过程中都降低了牙鲆体内的TH水平。D1在变态高峰期和变态后期受到外源TU处理的上调;D2和TRαB在高峰期被下调,高峰期后被上调;D3和TRβ在高峰期和变态后期被TU处理下调。本实验中,笔者证明了脱碘酶和甲状腺素受体对TH和TU处理有多样的不同的反应,表明它们可能在牙鲆的变态过程中具有互补的作用。笔者发现一个令人感兴趣的结果是脱碘酶和甲状腺素受体对TH和TU处理反应的时间依赖性差异。拯救实验中,D1和D2表达与TU组相比显著降低,而D3表达显示出明显的增加,特别是在TU+TH组中。这些结果进一步支持D3保护组织免受过量TH的伤害并与D1和D2起互补作用的观点。对于TRs来说,只有TRβ在救援实验中显示出显著的增加。结合外源TH和TU处理实验的结果,笔者认为TRα和TRβ在牙鲆变态过程中具有重要但不同的作用,而TRβ可能起主要作用。2、甲状腺素受体的结合蛋白及其受甲状腺素调控的变化本试验笔者选择认为在介导甲状腺素调控牙鲆变态过程中起主要作用的甲状腺素受体β(thyroid hormone beta,TRβ)为研究对象,制作多克隆抗体,利用免疫沉淀法在过表达TRβ的牙鲆胚胎细胞(flounder embryonic cell,FEC)中探索TRβ的相互作用蛋白。笔者从TRβ多克隆抗体与过表达TRβ的牙鲆胚胎细胞总蛋白的免疫沉淀复合物中鉴定得到了22个达到本次质谱鉴定阈值得分的可信牙鲆蛋白。GO(gene ontology)富集分析显示所鉴定的蛋白主要分布在核糖体、细胞质、细胞核、线粒体内膜、染色体以及胞外区域,其中绝大多数的蛋白集中在线粒体和细胞质中;主要具有ATP结合、未折叠的蛋白质结合、核糖体的结构组成、激酶活性、组蛋白去乙酰化酶活性、跨膜转运蛋白活性、GTP酶活性、翻译延长因子活性、过氧化物氧还原酶活性、水解酶活性、肌动蛋白丝结合、RNA结合、DNA结合、趋化因子活性以及细胞外基质结构组分这些分子功能;主要参与转录调控、翻译、蛋白质折叠和重折叠、细胞氧化还原内稳态、细胞分裂、核小体装配、雌激素应答、压力应答以及免疫应答的生物学进程。同时经KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析结果显示,鉴定的蛋白参与核糖体通路、细胞周期、内质网蛋白加工、MAPK信号转导通路、甲状腺激素信号通路、剪接体、粘着斑、氧化磷酸化、内吞作用、RNA降解、氨基酸物质代谢、胆汁分泌、信使RNA监测通路、沙门氏菌感染、单纯疱疹感染以及细胞因子受体相互作用途径中。笔者选择了可信度和综合得分最高的8个鉴定的蛋白进行进一步分析,分别为:ATP合酶β亚基(beta-F1-ATPase)、热休克蛋白90β(Hsp90β)、含有TCP1的伴侣蛋白亚基6A(Cct6A)、40S核糖体蛋白S15A(RPS15A)、肌酸激酶1(CK1)、溶质载体家族25α成员5(Slc25a5)、延伸因子1(EF1a)和组蛋白去乙酰化酶1-B(HDAC1-B)。这些蛋白在细胞的生命活动中都扮演着重要角色,其中组蛋白去乙酰化酶(HDACs)已在无尾目动物中被报道可与未结合配体的甲状腺素受体结合调控下游基因转录。进一步对编码它们的基因m RNA表达分析结果显示,它们的表达在外源甲状腺素处理后均表现出显著变化,其中beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、RPS15A、Slc25a5、EF1a和HDAC1-B的表达受外源甲状腺素处理显著下调,CK1相反,它的表达受甲状腺素处理显著上调;硫脲的处理对所分析的基因则几乎都没有明显影响。这些结果间接支持了所分析的可信蛋白与甲状腺素受体β之间的相互联系。3、牙鲆变态过程中蛋白质组受外源性甲状腺素影响的变化在本实验中,笔者通过TMT偶联的2D LC-MS/MS方法分析了TH处理和未处理的牙鲆幼体在变态过程中差异表达蛋白的类型和表达水平。使用实时定量PCR(RT-q PCR)和蛋白质印迹法(western blotting,WB)验证蛋白质表达水平的改变。并通过生物信息学方法进一步评估了这些差异表达的蛋白质在变态期牙鲆对外源TH处理响应中可能的生物学意义。笔者鉴定了815种对外源性甲状腺素刺激的响应显示出显著变化的蛋白质,其中412种蛋白质上调,403种下调。这些受甲状腺素影响显著变化的蛋白具有多种生物学功能。值得注意的是,在这里笔者发现了五组具有强相互作用并受甲状腺素显著调节的蛋白质,包括hbbe2-hbae1-pah,tnnt3a-zgc:92233-tpm1-myhz2-smyhc2-myh11a-tnnc2-ttnb-speg,fabp6-fabp3-apoba-apoa1a,rlbp1bopn1mw4-grk7a和gapdh-tkt-aldoaa-aldob-gpib-ldha-pkmb-idh1。蛋白质组定量分析结果显示,除了一种未知的蛋白质(zgc:92233)外,5个互作组中的2个(hbbe2-hbae1-pah和tnnt3a-zgc:92233-tpm1-myhz2-smyhc2-myh11a-tnnc2-ttnb-speg)被TH处理显著上调,另外3个组(fabp6-fabp3-apoba-apoa1a,rlbp1b-opn1mw4-grk7a和gapdh-tktaldoaa-aldob-gpib-ldha-pkmb-idh1)显著下调。进一步的研究显示,这两个受TH上调的蛋白互作组的蛋白已知分别参与血细胞形成和功能以及肌肉发育。另外三个受TH下调的蛋白互作组的蛋白质已知在生物能量代谢过程、视觉系统发育和代谢调节中起重要作用。总的来说,笔者从蛋白质组学的角度证实了甲状腺素增强牙鲆变态过程中血细胞的成熟,加强了牙鲆幼体的肌肉发育,同时也证实了视觉系统和能量代谢系统的弱化。