第一部分大鼠-小鼠嵌合体异种肺器官的研究研究背景利用人多功能干细胞培育组织/器官是再生医学的终极目标。但是体外器官发育十分复杂,通过干细胞体外分化而获得完整的器官是非常困难的。目前已有实验室通过异种囊胚互补技术在Pdx-/-胰腺缺陷的小鼠体内生长出大鼠PSC来源的胰腺组织。研究目的通过囊胚互补技术,将大鼠iPSCs注射到TTF-1-/-小鼠的囊胚中,在小鼠体内获得互补再生的大鼠iPSCs来源的肺器官,并检测和分析大鼠iPSCs在嵌合小鼠肺组织中的嵌合情况,来证明种间肺器官再生的可行性,为最终实现在猪体内培育出人源化的肺器官奠定良好的理论和实验基础。研究方法(1)取TTF-1+/-雌性小鼠和TTF-1+/-雄性小鼠交配后第19天的小鼠胎儿,通过H&E染色来观察其肺发育的情况。(2)通过碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)染色的方法,鉴定大鼠iPSCs的状态。同时,用 anti-C-myc,anti-Oct4,anti-SSEA-1 和 anti-Nanog 四种抗体,来检测大鼠iPSCs的潜能性。(3)通过显微操作技术,将大鼠iPSCs作为供体细胞注射到TTF-1+/-雌性小鼠和TTF-1+/-雄性小鼠交配后获得的囊胚中,其中一部分注射后的囊胚在体外培养并观察发育情况。另一部分注射后的囊胚移植到代孕母鼠体内,等到E19时取出胎儿,通过H&E染色观察肺发育情况,用TTF-1、CCSP、SP-C等肺特异性抗体检测嵌合体肺组织的细胞类别。(4)设计4个guideRNA,将Cas9mRNA和4个guideRNA混合,通过小鼠显微注射将Cas9 mRNA和guide RNA混合物注射到小鼠受精卵胞质中,在体外培养发育到囊胚,通过测序来鉴定囊胚基因型。实验结果(1)通过基因型和表型鉴定,发现TTF-1--基因型小鼠严重的肺发育缺陷,其胸腔中的两侧肺叶均消失,只留下囊泡状的肺叶残留。(2)大鼠iPSCs的AP染色呈阳性,干细胞特异性因子C-myc,Oct4,anti-SSEA-1和Nanog都是阳性表达。(3)通过荧光显微镜观察发现,大鼠iPSCs注射后的囊胚在体外培养12h和24h后,大鼠iPSCs在嵌合体胚胎中仍能强烈表达红色荧光。相比TTF-1-/-基因型小鼠发育异常的肺而言,大鼠iPSCs互补的肺有实质的填充。(4)通过小鼠显微注射将Cas9 mRNA和guide RNA混合注射到小鼠受精卵胞质当中,在体外培养发育到囊胚,通过测序来鉴定囊胚基因型,其中3#guide RNA和5#guide RNA识别的TTF-1靶向位点插入2个碱基。实验结论我们进行了 6次囊胚注射,并获得了一枚基因型是TTF-1-/-纯合子E19d小鼠。通过对该嵌合体小鼠的肺组织分析,发现相比TTF-1-/-基因型小鼠发育异常的肺而言,大鼠iPSCs互补的嵌合体肺组织中有实质的填充。我们通过TTF-1、CCSP、SP-C抗体免疫组化检测发现大鼠iPSCs补偿了肺组织中有正常肺组织的细胞,其中有Ⅱ型肺泡细胞,克拉拉细胞和肺早期近端的TTF-1阳性的肺前体干细胞的分布。第二部分 GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪器官/组织免疫原性的研究研究背景猪的器官/组织和红细胞将来可以解决临床上同种异体移植中人器官供体短缺问题,但是能被人抗体识别的异种抗原是猪器官/组织用于临床的障碍。同时敲除猪的GGTA1,CMAH和β4GalNT2这三个基因,将相应消除αGal,Neu5Gc和sd(a)三种异种抗原。已经有研究表明,GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除(TKO)猪的心脏瓣膜和心包膜可明显降低人抗体的结合能力。但猪的其他器官/组织的免疫原性还未知。研究目的检测TKO猪的不同器官/组织(心,肝,脾,肺,肾,胰腺,角膜,皮肤和红细胞)的免疫原性,为TKO猪作为异种移植供体应用于临床提供实验依据。研究方法(1)分别用BSI-B4和DBA凝集素来检测αGal和sd(a)抗原在野生型(WT)和TKO猪红细胞以及人红细胞上的表达,以及用chickenanti-Neu5Gc抗体来检测Neu5Gc在不同红细胞上的表达情况。用山羊抗人IgG/IgM抗体检测人AB血清孵育后的WT和TKO猪红细胞以及人红细胞,检测红细胞对人抗体的结合能力。(2)分别从WT,GTKO和TKO猪获取角膜组织用于组织学检测,通过H&E染色来检测角膜的组织形态和细胞结构。用BSI-B4和DBA凝集素来检测αGal和sd(a)抗原在不同角膜组织上的表达,以及用chicken anti-Neu5Gc抗体来检测Neu5Gc在角膜组织上的表达情况。用山羊抗人IgG/IgM抗体检测人AB血清孵育后的不同角膜组织,检测不同组织和人抗体的结合能力。(3)分别从WT和TKO猪获取不同的器官/组织(心,肝,脾,肺,肾,胰腺和皮肤)用于组织学检测。通过H&E染色来检测不同组织形态和细胞结构。用BSI-B4和DBA凝集素来检测αGal和sd(a)抗原在不同组织上的表达,以及用chicken anti-Neu5Gc抗体来检测Neu5Gc在不同组织上的表达情况。用山羊抗人IgG/IgM抗体检测人AB血清孵育后的不同组织,检测不同组织和人抗体的结合能力。实验结果(1)通过流式细胞仪分析的结果显示在WT猪红细胞表面αGal,sd(a)抗原和Neu5Gc都有明显的表达,TKO猪来源的红细胞以及人红细胞表面均未检测到表达。人IgG/IgM抗体结合到人红细胞和TKO猪红细胞的水平明显低于人IgG/IgM抗体结合到WT猪红细胞的水平(p<0.01),并且人IgG抗体结合到TKO猪红细胞的水平略高于人IgG抗体结合到人红细胞的水平,但是人IgM抗体结合到TKO猪红细胞的水平和人IgM抗体结合到人红细胞的水平没有显著性差异。(2)通过HE组化分析发现WT,GTKO/CD46和TKO三种不同猪的角膜结构和细胞形态均没有差异,说明基因改造猪的角膜结构未发生变化。通过免疫荧光分析发现,αGal在WT猪角膜表面总体上表达量很低,仅在角膜的前基质层的少量角膜细胞呈现αGal弱阳性。但是,在GTKO/CD46和TKO猪角膜中均未检测到αGal的表达。在WT和GTKO/CD46猪角膜上皮层前部的角膜细胞均有sd(a)抗原和Neu5Gc表达。但是sd(a)抗原和Neu5Gc在TKO猪角膜中没有表达。结果显示WT猪角膜广泛地结合人IgG和IgM抗体。相对于WT猪角膜而言,在GTKO/CD46和TKO猪角膜中人IgG和IgM抗体结合的能力显著降低。但是,GTKO/CD46和TKO猪角膜仍有人IgG和IgM抗体的结合。说明通过降低猪αGal,NeuGc和sd(a)抗原的表达,可以明显降低角膜组织和人抗体的结合能力,即降低了猪角膜组织的免疫原性。(3)通过HE组织化学分析发现WT和TKO猪的不同组织(心,肝,脾,肺,肾,胰腺和皮肤)结构和细胞形态均没有差异,说明基因改造均未影响猪的组织结构。通过免疫荧光分析发现,αGal,sd(a)抗原和Neu5Gc在WT猪所有上述组织都有广泛的表达,而TKO猪的组织中均未检测到三种抗原的表达。TKO猪的角膜,心肌,肺脏和肾脏组织结合人IgG/IgM抗体的能力有所减弱。但是在TKO的肝脏,脾脏,胰腺和皮肤组织中,人IgG/IgM抗体的结合能力并没有减弱。实验结论通过基因编辑技术敲除猪的GGTA1,CMAH和β4GalNT2这三个基因,进而将相应的αGal,Neu5Gc和sd(a)三种异种抗原消除后,TKO猪红细胞结合人IgG/IgM抗体的能力显著性减弱,即降低了猪红细胞的免疫原性。通过相关的凝集素和抗体,我们检测了 αGal,sd(a)抗原和Neu5Gc在心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺和皮肤中的表达情况,并且免疫荧光染色结果表明这三种糖蛋白呈现组织特异性分布,其中在WT猪的组织的小血管或毛细血管内皮表达比较高,相应的在我们的TKO猪的组织中均未检测到表达。TKO猪的心肌,肺脏和肾脏组织结合人IgG/IgM抗体的能力有所减弱,这说明可能通过基因修饰可以减少这些组织对人IgG/IgM抗体的反应。但是在TKO的其他组织中,人IgG/IgM抗体的结合能力并没有减弱,可能是这些组织中猪白细胞抗原(SLA)在异种抗原中占有主要作用。