论文部分内容阅读
蛋白质是细胞生物功能最主要的承担者。但大多数细胞的生物学功能都是由蛋白质复合物而非单个蛋白质来完成,蛋白质复合物是蛋白质在体内发挥功能作用的一种重要形式。质膜作为细胞内外物质交换和信息交流的场所,涉及众多蛋白质的共同作用来完成这些重要的生理功能。因而质膜蛋白质更加容易形成复合物,成为了复合物蛋白质组学研究的热点。对蛋白质复合物尤其是质膜蛋白质复合物的鉴定,有利于我们从整体上理解蛋白质-蛋白质相互作用网络。然而,鉴定蛋白质复合物最主要的限制因素是蛋白质复合物的分离方法。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue native-PAGE or BN-PAGE)技术是分离膜蛋白质复合物强有效的工具。这项技术依靠考马斯亮蓝G-250染料使蛋白质带上负电荷,同时采用温和的非离子型去垢剂增溶膜样品,使膜蛋白质复合物在近似天然的状态下根据分子量大小得到分离。在蛋白质复合物得到分离后,可以切下第一向的泳道进行第二向SDS-PAGE,就能将各个复合物的亚基进行分离。该方法可以用来研究膜样品中多种复合物的组成,然而在突触质膜复合物方面的研究中却应用的很少。本实验中,我们建立并优化了Blue native-PAGE分离突触质膜蛋白质复合物方法,并成功用于分析D-半乳糖诱导的C57 BL/6小鼠大脑皮层中突触蛋白质表达的变化。最近研究发现,通过连续注射D-半乳糖到啮鼠动物体内产生的糖基化终末产物(AGEs)会导致学习与记忆功能的减退,即AGEs与神经疾病有关。在神经疾病中出现的学习与记忆功能退化或大脑病变都可能与突触中蛋白质的表达量的变化有关。为了评估AGEs对突触蛋白质表达的影响,我们结合使用BN/SDS-PAGE与质谱蛋白质组学方法,比较D-半乳糖诱导的C57 BL/6小鼠和正常的C57 BL/6小鼠大脑皮层突触蛋白质的表达情况。首先通过不连续蔗糖密度梯度离心的方法制备突触质膜,然后用Blue native-PAGE结合SDS-PAGE对纯化的突触质膜样品进行电泳分离,再经胶内酶解,最后结合LC-MS/MS质谱对各复合物的组分进行鉴定以及对诱导组与对照组进行差异蛋白质组学分析。我们找到了一些已知的蛋白质复合物如syntaxin1B和synaptotagmin-1,同时也发现了一种潜在的新的蛋白质复合物,即rab3A和synaptotagmin-1。一共鉴定到了43个差异表达蛋白质,这些差异表达蛋白质主要参与体内的神经传递、能量代谢以及信号转导等过程。同时我们对部分感兴趣的差异表达蛋白质在Western-Blotting水平进行了验证,结果与质谱鉴定结果一致。另外,我们检测了MDA和SOD的活性,发现在D-半乳糖诱导的C57 BL/6小鼠中,SOD的平均活力显著下降,而MDA水平则上升了。这些结果表明,在大脑中AGEs的累积导致了活性氧(ROS)的生成,破坏了能量代谢以及减弱了突触中神经传递。因此,阐明在AGEs累积过程中的蛋白质变化将有利于我们进一步了解在神经疾病中学习与记忆缺损机制。总之,本实验为质膜蛋白质组学研究中的膜蛋白质复合物的分离纯化、膜蛋白质的差异分析等提供了一些方法学上的参考；证明了Blue native-PAGE/SDS-PAGE是一种有效地分离膜蛋白质的手段。同时本实验在C57 BL/6小鼠大脑突触质膜蛋白质复合物方面的工作将给大脑皮层神经突触生理和病理等功能的研究以及相关的神经疾病分析提供有用的信息。