论文部分内容阅读
目的:分析miRNA在恶性转化细胞中的表达差异,利用GINI技术和基因芯片技术,初步筛选黄曲霉毒素作用L02细胞的基因靶点。方法:首先通过RT-PCR技术确定L02细胞内含有黄曲霉毒素B1的代谢活化酶CYP1A2,然后以黄曲霉毒素AFB1(终浓度1μg/ml)作用正常生长的L02细胞一周,用软琼脂克隆实验证实细胞已经发生恶性转化,具有恶性细胞的特性。通过miRNA基因芯片技术检测正常L02细胞和AFB1转化细胞中miRNA的基因表达差异。再根据GINI技术的原理,用emetine阻断转化细胞内自我修复途径——无意义介导的衰变(nonsense-mediated decay,NMD),利用基因芯片技术比较加入emetine和未加入emetine的L02+AFB1细胞表达有差异的基因,在上调的基因中初步筛选AFB1可能作用的靶基因。结果:RT-PCR结果显示L02细胞中有CYP1A2表达。miRNA芯片分析显示主要的上调基因为hsa-miR-671-5p,下调基因为hsa-miR-96,他们都与蛋白合成、免疫系统、细胞生理功能密切相关,其中和肿瘤的发生密切相关的靶mRNA和蛋白是IGF2,锌指蛋白和早期未成熟密码子。通过emitine抑制NMD途径,在上调基因中发现TSC1基因、EphA2基因与癌症发生密切相关。结论:黄曲霉毒素B1诱导人胚肝细胞L02发生了恶性转化,其实基因表达谱产生差异。microRNA作用的靶基因与多种蛋白合成、免疫系统、细胞生理功能等密切相关,在癌症的发生发展中具有重要作用。GINI技术是一种能快速有效监测出致癌物作用细胞的靶基因的方法。在后续试验中,将用RT-PCR和northern blotting进一步验证和确定基因芯片结果的准确性。