近年来骨质疏松的发病率在全球范围内逐年升高,已经成为威胁人类健康的重要慢性疾病。骨质疏松症是因骨形成和骨吸收二者之间的活动失衡所引起的骨矿物质沉积减少和骨微结构破坏,最终导致骨脆性增高和骨折危险性增加的一种全身性骨病。破骨细胞是一种终末分化的多核巨细胞,其前体细胞来源于造血干细胞,在多种细胞因子及激素的诱导下,可以分化融合成成熟的破骨细胞。骨骼中破骨细胞数量及活性的异常与多种骨代谢性疾病有关,如骨质疏松症,骨硬化症及风湿性关节炎等。因此,抑制破骨细胞的形成及其活性,对于开发研制治疗骨质疏松症的新药物,具有重要意义。杨梅苷,系五羟基黄酮-3-鼠李糖苷,为一种多酚羟基黄酮苷类化合物,大量存在于杨梅的果实、树皮、树叶及其他多种天然植物中。具有改善微循环、抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等多种药理活性。本课题建立了RAW264.7细胞培养体系、确定了诱导RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞的最佳条件,通过CCK-8细胞毒性实验、TRAP染色实验、RT-PCR实验明确了杨梅苷对破骨细胞分化成熟的抑制作用。目的:建立RAW264.7细胞系,并诱导出分化成熟的破骨细胞。明确杨梅苷对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。方法:实验分为两个部分:1.RAW264.7细胞系的建立及破骨细胞的诱导:绘制RAW264.7细胞增殖曲线,根据增殖曲线确定传代时间;用胰酶消化后,在不同时间点显微镜下观察细胞消化状态,确定胰酶消化时间;根据传代时的细胞密度,计算出细胞冻存密度,并进行验证;以不同浓度的RANKL作用与不同接种密度的RAW264.7细胞,诱导5天后TRAP染色,镜下计数成熟破骨细胞的数量并进行统计学分析,筛选出破骨细胞的最佳诱导条件。2.杨梅苷对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响:通过CCK-8法确定不同浓度(1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)的杨梅苷对RAW264.7细胞活性的影响。分别用50μg/L的RANKL、50μg/L RANKL+1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L的杨梅苷诱导RAW264.7细胞5天。对形成的破骨细胞进行TRAP染色并计数,TRAP染色阳性且细胞核数目≥3个认为是成熟的破骨细胞。50μg/L的RANKL、50μg/L RANKL+1.25mg/L、10mg/L的杨梅苷培养RAW264.7细胞24小时,使用实时定量PCR检测破骨细胞分化相关基因C-Fos、NFATc1、Ctsk、TRAP的表达。结果:第一部分:(1)RAW264.7细胞传代时间为5-6天,消化方法为胰酶消化1.5分钟,然后用培养基轻轻吹打数次,细胞的冻存密度为≥50×104个/m L。(2)破骨细胞的最佳诱导条件为:细胞接种密度3×104个/m L,RANKL浓度为50μg/L,培养基更换为α-MEM培养基。第二部分:(1)当用1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L浓度的杨梅苷作用于RAW264.7细胞后,无明显细胞毒性,可作为后续实验的用药浓度。(2)当用1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L浓度的杨梅苷作用于RAW264.7细胞,TRAP染色结果显示,杨梅苷可以抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向成熟破骨细胞的分化,且呈剂量依赖关系。(3)当用1.25mg/L、10mg/L浓度的杨梅苷作用于RAW264.7细胞,RT-PCR结果显示,杨梅苷可以抑制破骨细胞分化相关基因C-Fos、NFATc1、Ctsk、TRAP m RNA的表达。结论:RAW264.7细胞系成功建立,确定了诱导破骨细胞的最佳条件。杨梅苷对RAW264.7细胞无毒性,通过下调相关基因的表达抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成。杨梅苷可作为治疗骨质疏松症的潜在药物。