我国丰富的玉米秸秆资源没有被充分利用而废弃造成了有效资源的浪费和严重的环境污染。为了提高秸秆资源综合利用效率,国家制定了《“十三五”秸秆综合利用实施方案》,《方案》指出应不断完善秸秆收储运体系,持续推进秸秆肥料化、饲料化、燃料化、基料化和原料化综合利用。微生物在秸秆饲料化、肥料化等农业为主的秸秆综合利用中是核心,所以筛选、构建、分析具有特定功能的微生物在秸秆资源综合利用中具有重要意义。目前,我国已经成功筛选出大量高产纤维素酶的菌株,但大部分集中在真菌方面研究,大多数真菌可高产纤维素酶,但由于培养时间长,温度和p H耐受性差等原因使其在工业上生产具有一定局限性。益生菌与真菌相比具有更强的优势,尤其是芽孢杆菌,芽孢杆菌因易筛选,抗逆性强(耐酸,耐碱,耐高温),而易于工业化生产。有些芽孢杆菌可产生丰富的木质纤维素酶,所以在生物质转化方面中发挥重要作用。因此,本研究利用多种木质纤维素酶筛选培养基,从杜仲树皮内筛选到一株植物内生菌,命名为Bacillus velezensis 157,该菌株具有产生丰富木质纤维素酶优势,同时具有抑制病原细菌和真菌的能力。进而对其生物学特性进行分析、CMCase产酶条件优化以及酶学性质分析研究。系统地开展了对Bacillus velezensis157全基因组测序、生物信息学分析、木质纤维素降解酶基因的挖掘,比较基因组学揭示了Bacillus velezensis同种间携带木质纤维素降解酶基因情况。最后将Bacillus velezensis 157分别在固态发酵预处理秸秆、发酵豆粕以及混合固态发酵预处理秸秆-豆粕混合物(AWC)等应用基础研究实验中,利用扫描电镜、傅里叶转换红外光谱、GC-MS产物分析、木质纤维素含量测定等试验评价Bacillus velezensis 157固态发酵预处理秸秆,豆粕以及预处理秸秆-豆粕混合物的降解效果,详细分析了各组产纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶,进一步通过单因素法优化混合固态发酵产酶条件等。预期结果将对生物质能源的转化与利用提供新的创新思路。主要研究内容及结果如下:1.高产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定及部分生物学特性分析本研究成功在杜仲树皮内分离一株芽孢杆菌,经菌落形态、传统生理生化鉴定、全自动微生物鉴定系统和16S r RNA分子生物学技术初步鉴定芽孢杆菌157为Bacillus velezensis。该菌株能够在p H2-12条件下生长、其最适p H为6,可以耐受0.4%胆盐和85℃高温。该菌株具有丰富的内切纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木质素酶等胞外酶活力。在未经液态发酵优化前,其CMCase和FPAse分别可达4.78 IU/m L和0.73 IU/m L。Bacillus velezensis 157对19种兽医临床常用的抗生素敏感,动物试验安全无毒。Bacillus velezensis 157胞外提取物具有广谱抑菌作用,对7种动物病原细菌(Staphylococcus aureus CVCC519、Escherichia.coli CVCC233、Escherichia.coli CVCC236、Escherichia.coli CVCC196、Escherichia.coli CVCC205、Escherichia.coli BNCC125988、Salmonella Typhimurium ATCC25241、Salmonella choleraesuis CVCC3383、Salmonella choleraesuis CVCC3775、Salmonella choleraesuis CVCC79102、Salmonella choleraesuis CVCC503、Salmonella choleraesuis CVCC3780、Salmonella enteritidis CVCC3378、Clostridium perfringens、Proteus hauseri)、4种水产病原细菌(Aeromonas hydrophila ATCC7966、Aeromonas veronii ATCC35624、Aeromonas veronii TH0426、Aeromonas veronii AV115、Aeromonas veronii AV75、Aeromonas caviae ATCC15468、Streptococcus agalactiae)、2种植物病原真菌(Botrytis cinerea和Fusarium oxysporum)均有一定抑制作用。2.Bacillus velezensis 157 CMCase产酶条件优化及其酶学性质分析以CMC为碳源(3g/L)、酵母浸粉为氮源(3g/L)、3%接菌量、p H=7的条件下37℃培养48小时,产酶条件优化后Bacillus velezensis 157的CMCase最高可达5.08±0.14 IU/m L。经CMCase酶学性质分析发现Bacillus velezensis 157的最适酶反应温度为60℃、最适p H为5、具有较好的p H稳定性和Na Cl耐受性,属于内切型纤维素酶。Km=5.59 mg/m L、Vmax=5.81μg/m L·min、Na+、Mg2+、Ca2+可以诱导Bacillus velezensis157 CMCase,而Co2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性剂Tween 80、Tween 20、Triton X-100对Bacillus velezensis 157的CMCase无影响。为了实验分析构建了重组Bacillus velezensis157 CMCase的原核表达菌株p ET32a-157-CMCase BL21(DE3),并进行了重组CMCase的酶学性质分析,其最适酶反应温度和p H值分别为50℃和p H6,具有较好的p H耐受性,与野生菌株Bacillus velezensis 157 CMCase的酶学性质相似,但重组Bacillus velezensis 157 CMCase具有更好的温度稳定性和底物亲和力,为实验研究提供了方便。3.Bacillus velezensis 157全基因组测序及比较基因组分析对Bacillus velezensis 157进行了全基因组测序发现其具有一个环形染色体和环形质粒分别为4,013,317bp和8439bp,同时,全基因组含有8个次级代谢基因簇,占全基因组比例的15.8%,主要包括:Surfactin、Butirosin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacilysin。除此之外,Bacillus velezensis 157基因组中还具有降解纤维素、木聚糖、淀粉、甘露聚糖、半乳糖和阿拉伯聚糖的木质纤维素酶基因。经24株Bacillus velezensis比较基因组学研究发现Bacillus velezensis菌株之间具有众多共同的木质纤维素降解酶基因,且主要针对纤维素和半纤维素的降解;其中,参与纤维素降解的共有GH家族主要包括:GH1、GH4、GH5、GH13、GH16、GH30、GH32;涉及半纤维素降解的共有GH和CE家族包括:GH11、GH26、GH43、GH51、GH53、CE3和CE7。而缺乏降解木质素的相关酶基因,仅涉及AA4、AA6、AA7、AA10。4.Bacillus velezensis 157在混合固态发酵预处理玉米秸秆-豆粕产酶功能的研究通过对Bacillus velezensis157在固态发酵最适底物的筛选发现,豆粕是Bacillus velezensis 157固态发酵的最适底物。与其他底物相比,其CMCase、Amylase和Pectinase的最高酶活力分别可达46.69±1.19 U/g、2097.18±15.28 U/g和19.15±2.66 U/g。为了提高Bacillus velezensis157固态发酵玉米秸秆的利用率和产酶量,将玉米秸秆进行稀碱预处理后与豆粕进行混合发酵,并对其固态发酵条件进行优化,发现碱处理秸秆与豆粕的比例为1:1,底物与水的比例为1:0.5,在37℃下发酵24h,其产生的CMCase、Amylase、Xylanase以及Pectinase均高于单一发酵豆粕组和碱处理玉米秸秆组,其酶活力分别可达56.83±1.47 U/g(P<0.01)、1949.28±14.41U/g(P<0.01)、16.52±0.79 U/g、14.53±0.56 U/g(P<0.01)。通过扫描电镜、傅里叶转换红外光谱、木质纤维素含量测定以及GC-MS分析等技术,对Bacillus velezensis 157固态发酵碱处理秸秆组AWC组以及豆粕组的降解效果进行评价。经扫描电镜观察发现,Bacillus velezensis 157固态发酵AWC组出现大面积木质纤维素降解孔洞,菌株数量大幅增加密集排布。经FTIR、木质纤维素含量测定以及GC-MS分析发现AWC组中部分纤维素和半纤维素出现大量降解,经过10天发酵,纤维素和半纤维素降解率分别为9.06%和43.61%,AWC组GC-MS降解产物中葡萄糖、甘露醇、半乳糖、木糖、纤维二糖、麦芽三糖醇以及葡萄糖醛酸等物质的峰面积增强,主要是纤维素无定型区、半纤维素以及淀粉发生了降解。综上所述,本文筛选的杜仲树皮内生菌Bacillus velezensis 157,通过试验验证具有降解纤维素和半纤维素能力;此外,通过对Bacillus velezensis 157的部分生物学特性研究和酶学性质分析以及全基因组测序分析等获得的数据为下一步应用奠定了基础。也为Bacillus velezensis 157进一步应用于固态发酵处理农业废弃物提供了参考,具有重要意义。