猪链球菌溶源性噬菌体裂解酶的挖掘与Ply5218的生物活性研究

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猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一类重要的人兽共患病原菌,可导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎以及人的脑膜炎,对养猪业和公共卫生构成严重威胁。目前对该病菌的防控主要采用抗生素治疗,然而由于抗生素的滥用,细菌耐药问题严重,给该病的防控带来了困难。噬菌体裂解酶(Lysin)因其快速高效的体外杀菌效果,逐渐成为一种有潜力的新型抗菌制剂。因此,挖掘新型裂解酶对于该病的防控颇具研究和应用价值。本论文基于GenBank中收录的猪链球菌基因组信息,挖掘到猪链球菌9型(SS9)菌株5218基因组上前噬菌体编码的裂解酶(命名为Ply5218)分析发现其具有潜在研究价值,本论文将其作为研究对象。采用重组表达技术获得Ply5218蛋白,通过常规克隆技术和测序后,成功获得表达菌株Ply5218-pET28a(+)-BL21,经IPTG在27℃诱导4h后,可获得分子量约为35KDa的目的蛋白。裂解酶Ply5218的体外裂菌特性实验结果显示:其裂菌谱较广,36株被测的猪链球菌中34株可被裂解;浊度递减实验可在15min内使猪链球菌2型(SS2)强毒株HA9801的OD600从1.0下降到0.2,最小抑菌浓度(MIC)为2.0μg/mL,具有高效的杀菌作用;Ply5218的热稳定好,50℃处理30min对酶活无影响,可在4℃保存30天,在﹣80℃保存1年以上;添加浓度为1mM的Ca2+对其酶活发挥有增强作用;此外,裂解酶在牛奶和THB等体系内仍保持较高的酶活,具有高稳定性的特点。本文采用BALB/c小鼠腹腔攻击-腹腔给药治疗模型评价Ply5218的体内抗感染效果。经腹腔注射0.2mL(1.4×1010CFU/mL)复壮的SS2强毒株HA9801,攻击后2h,分两组经腹腔注射0.2mL(1mg/mL)的裂解酶和PBS进行治疗,观察小鼠的存活状态。结果显示治疗后的36h内,Ply5218治疗组小鼠存活率达到90%(9/10),对照组存活率为20%,裂解酶治疗呈现出优异的保护力。综上所述,采用体外重组技术能高效表达可溶性Ply5218,其活性高,可快速、高效杀菌;热稳定性强、在非Buffer体系尤其是牛奶中可以保持很高的活性,具有开发应用前景;采用BALB/c小鼠模型开展治疗保护试验,确认Ply5218可以有效清除猪链球菌2型高致病力菌株HA9801的感染,为采用噬菌体裂解酶防控猪链球菌感染及开展进一步相关研究提供了数据支持。
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