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背景:血管管周细胞、微血管内皮细胞及星形胶质细胞血管生成素-1(Ang-1)/血管生成素-2(Ang-2)比值的下调是脑缺血再灌注诱发血脑屏障损伤的重要机制。二十二碳六烯酸(DHA)在维持细胞膜的正常结构和生理功能方面具有重要的意义,是人体一种不可缺少的不饱和脂肪酸。DHA可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,减少血脑屏障通透性、保持血脑屏障完整;进一步研究的发现DHA可通过上调Ang-1的表达,减少Ang-2分泌,发挥对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)是蛋白激酶C的一种作用底物,在维持细胞连接、细胞形态、调节细胞通透性等方面起重要作用,可上调脑星形胶质细胞Ang-1的表达,改善血脑屏障功能。但DHA调节Ang表达的分子机制是否与脑血管周细胞、内皮细胞及星形胶质细胞SSeCKS有关尚有待研究,本研究通过制备人脑血管周细胞(HBVPs)氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型,拟对此进行评价。目的:评价DHA调节HBVPs氧糖剥夺/复氧复糖时Ang表达的机制与SSeCKS的关系。方法:1.随机数字法将人HBVPs分为10组:正常对照组(C组);氧糖剥夺6h/复氧复糖2h(Q6R2组);氧糖剥夺6h/复氧复糖6h(Q6R6组);氧糖剥夺6h/复氧复糖12h(Q6R12组);氧糖剥夺12h/复氧复糖2h(Q12R2组);氧糖剥夺12h/复氧复糖6h(Q12R6组);氧糖剥夺12h/复氧复糖12h(Q12R12组);氧糖剥夺24h/复氧复糖2h(Q24R2组);氧糖剥夺24h/复氧复糖6h(Q24R6组);氧糖剥夺24h/复氧复糖12h(Q24R12组)。C组正常培养,其余各组依据氧糖剥夺和复氧复糖时间分别进行相应时长处理,氧糖剥夺环境为无糖无血清培养基置于含94%N2:5%CO2:1%O2的三气培养箱中培养,复氧复糖环境为含糖含血清培养基置于含5%CO2的培养箱37℃培养。用倒置显微镜观察各组细胞的形态、是否贴壁及是否有脱落等情况,CCK-8检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.随机数字法将HBVPs分为正常对照组(C组);氧糖剥夺/复氧复糖组(Q组);高剂量DHA预处理组(H组);低剂量DHA预处理组(L组);正常对照+SSeCKS基因沉默组(S组);氧糖剥夺/复氧复糖+SSeCKS基因沉默组(QS组);高剂量DHA预处理SSeCKS基因沉默组(HS组);低剂量DHA预处理SSeCKS基因沉默组(LS组)。C组按照正常细胞培养条件培养,Q组无糖无血清培养基三气培养箱培养24h后更换为含糖含血清培养基普通培养箱培养6h后收集标本。DHA预处理组在氧糖剥夺处理前lh分别加入终浓度为40μM和10μM的含DHA培养基,然后进行后续处理。SSeCKS基因沉默各组按照SSeCKS siRNA(h)(Santa,美国)和配套转染试剂(Santa,美国)说明书进行siRNA转染,检测沉默效率达标后用于实验。Western Blot法检测SSeCKS基因沉默效果;分别在复氧复糖后2h、6h、12h及24h用LDH ELISA试剂盒检测各组细胞毒性,用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡及坏死状态,提取总蛋白用western blot法检测各组细胞SSeCKS蛋白含量。3.随机数字法将HBVPs分为正常对照组(C组);氧糖剥夺/复氧复糖组(Q组);高剂量DHA预处理组(H组);低剂量DHA预处理组(L组);正常对照+SSeCKS基因沉默组(S组);氧糖剥夺/复氧复糖+SSeCKS基因沉默组(QS组);高剂量DHA预处理SSeCKS基因沉默组(HS组);低剂量DHA预处理SSeCKS基因沉默组(LS组)。C组按照正常细胞培养条件培养,Q组无糖无血清培养基三气培养箱培养24h后更换为含糖含血清培养基普通培养箱培养6h后收集标本。DHA预处理组在氧糖剥夺处理前1h分别加入终浓度为40μM和10μM的含DHA培养基,然后进行后续处理。SSeCKS基因沉默各组按照SSeCKS siRNA(h)(Santa,美国)和配套转染试剂(Santa,美国)说明书进行siRNA转染,检测沉默效率达标后用于实验。ELISA检测试剂盒检测复氧复糖后2h、6h、12h及24h时间点细胞培养上清液中Ang-1、Ang-2及VEGF分泌水平,提取总蛋白用Western Blot法检测复氧复糖后2h、6h、12h及24h时间点Ang-1、Ang-2及VEGF蛋白表达水平。结果1.倒置显微镜下可以看到对照组细胞状态良好,可见明显细胞核。缺氧复氧时间延长以后,存活细胞数逐渐减少。缺氧24h复氧2h时,可见少量脱落细胞漂浮在培养皿上,随着复氧时间增加,圆形漂浮细胞明显增多,至9h后,漂浮细胞数目超过50%;以对照组正常培养相应时长的细胞存活率为100%计算,到氧糖剥夺24h/复氧复糖6h时只有50%细胞的存活,至氧糖剥夺24h/复氧复糖12h时只剩30%的细胞存活;HBVPs的凋亡率与氧糖剥夺/复氧复糖的时间呈相关性,缺氧复氧损伤后,细胞的调亡率明显升高。与对照组相比,氧糖剥夺24h/复氧复糖6h后细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.依试剂说明书推荐条件转染12h后,SSeCKS蛋白含量显著下降、24h达低值、持续到转染后120h,其最佳抑制蛋白表达时间在转染48h后,抑制率接近50%;在复氧复糖后相同时间点,跟C组相比,Q组LDH漏出量明显增加(P<0.05),L组LDH漏出量相对Q组减少(P<0.05),H组相对Q组LDH漏出量减少更加明显(P<0.05)。S组与C组相比,LDH漏出量差异不明显(P>0.05),QS组相比于C组漏出量增加(P<0.05),LS组和HS组与QS组相比差异不明显,与C组相比漏出量增加(P<0.05),L组与LS组、H组与HS组相比差异均不明显(P>0.05)。随着缺氧复氧时间延长,LDH漏出量逐渐增加,各组相比于前一时间点,LDH漏出量均相应增加(P<0.05);相对于C组,Q组细胞存活率稳定在50%左右,L组及H组细胞存活率明显升高(P<0.05),且H组的细胞存活率高于L组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。S组细胞存活率相对正常组无明显下降(P>0.05),QS、LS组及HS组相较于C组及S组均下降明显(P<0.05),且三组之间比较无差异(P>0.05)。跟前一个复氧复糖后时间点相比,后一个时间点相同组别细胞存活率均有下降(P<0.05);Q组细胞比C组细胞凋亡明显增加(P<0.05),L组和H组相对Q组凋亡减少(P<0.05),且二者比较差异有显著性(P<0.05);S组与C组相比,细胞凋亡无明显增加(P>0.05),QS组、LS组及HS组凋亡增加明显(P<0.01),三者之间相互比较差异无显著性(P>0.05),HS组高于H组(P<0.01),LS组高于L组(P<0.01)。随着复氧复糖时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加,且两两比较差异显著(P<0.05)。相同时间点内,相比于C组,其余各组SSeCKS蛋白含量均明显下降(P<0.05);相比于Q组,H、L组增加明显(P<0.05);相比于S组,QS、LS及HS组差异不明显(P>0.05),L组与LS组、H组与HS组相比差异明显(P<0.05)。各时间点之间比较,相同组别SSeCKS蛋白含量逐渐下降,相比较有显著差异(P<0.05);3.在复氧复糖的各个时间点,与C组相比,除S组外其他各组Ang-1分泌量及蛋白含量均显著下降(P<0.01)。与Q组比较,L组和D组分泌量及蛋白含量增加明显(P<0.05),且高剂量DHA组增加高于低剂量组(P<0.05);与QS组比较,LS和HS组Ang-1分泌量及蛋白含量增加差异无显著性(P>0.05);与L组相比,LS组含量下降(P<0.05);HS组也低于H组(P<0.05)。与复氧复糖2h比较,随着复时间的延长,相应组别分泌量及蛋白含量差异逐渐显现(P<0.05);与C组相比,Ang-2在Q组分泌量及表达量明显增加(P<0.05),S组无改变(P>0.05),余组均有不同程度增加(P<0.05);与Q组相比,L组及H组均下降(P<0.05),且H组下降更明显(P<0.05);与S组相比,QS组、LS及HS均上升明显(P<0.01);相比于L组,LS组分泌量及蛋白含量增加明显;跟H组相比,HS组也呈明显上升改变(P<0.05);QS、LS及HS三者相比较差异不明显(P>0.05);在处理后相同时间内比较,与C组相比,VEGF在Q组分泌量及蛋白含量明显增加(P<0.05),S组无改变(P>0.05),余组均有不同程度增加(P<0.05);与Q组相比,L组及H组均下降(P<0.05),且H组下降更明显(P<0.05);与S组相比,QS组、LS及HS均上升明显(P<0.01);相比于L组,LS组分泌量及蛋白含量增加明显;跟H组相比,HS组也呈明显上升改变(P<0.05);QS、LS及HS三者相比较差异不明显(P>0.05)。不同时间点内比较,差异不显著(P>0.05)。结论:1.经氧糖剥夺24h/复氧复糖6h后,可造成HBVPs细胞明显损伤,细胞活力稳定在50%左右,凋亡率下降明显,且重复多次结果稳定。2.分别给予终浓度为40μM和10μM的DHA预处理氧糖剥夺/复氧复糖的HBVPs可以明显改善细胞状态,提高存活率,减少细胞凋亡,且高浓度DHA保护效果更明显。3.HBVPs氧糖剥夺-复氧复糖时SSeCKS表达下调,而给予DHA预处理后,HBVPs氧糖剥夺-复氧复糖时SSeCKS表达上调,进一步进行SSeCKS基因沉默后,Ang-1表达下调,Ang-2表达上调,Ang-1/Ang-2比值降低,DHA对氧糖剥夺-复氧复糖HBVPs的保护作用消失,提示DHA增加Ang-1/Ang-2比值,减轻HBVPs氧糖剥夺-复氧复糖损伤的机制与上调SSeCKS表达有关。此外,本研究还发现,与氧糖剥夺/复氧复糖组相比,SSeCKS蛋白沉默组细胞存活率,LDH漏出量均无显著差异,这提示DHA对HBVPs的保护作用可能是完全通过上调SSeCKS而实现的。